王大虎

王大虎:蛋白质相互作用

王大虎  用CE进行蛋白质本身反应及和小分子相互作用研究是研究热点,如蛋白质结合或降解反应、酶动力学、抗体-抗原结合动力学、受体-配体反应动力学等,蛋白质和DNA分析始终是毛细管电泳研究的重点,且今后会有更多的研究。

实例1:毛细管区带电泳对M蛋白的免疫分型

(1)材料 新鲜血清。

(2)试剂 法国Sebia公司配套试剂。

(3)仪器 法国Sebia公司Capillarys-2型全自动毛细管电泳分析仪。

(4)实验方法 将含有待检血清和抗体小杯(含缓冲液,抗IgG重链、抗IgA重链、抗IgM重链抗体及抗κ轻链、抗λ轻链抗体)的样品架放入电泳分析仪,电泳分析仪自动完成血清蛋白电泳和血清免疫电泳,得到血清蛋白电泳图谱和5个血清免疫电泳图谱,通过比较即可判定单克隆免疫球蛋白的类型,全过程约20min。

王大虎 (5)结果分析 样品分别与缓冲液,抗IgG重链、抗IgA重链、抗IgM重链抗体及抗κ轻链、抗λ轻链抗体6种试剂混合,样品中相应抗原与试剂中的抗体结合后沉淀,经过免疫沉淀的样品分别通过6X细管进行电泳,得到6个电泳图谱,其中经过沉淀的蛋白质在电泳图谱中将被消除,通过比较抗体沉淀后的蛋白质电泳图谱与未经沉淀的普通蛋白质电泳图谱,即可得出其免疫分型结果,见图5-23。如图5-23所示,与抗IgG重链抗体及抗κ轻链抗体作用后的血清中特征性M蛋白峰消失,而另外3个抗体作用后的图谱未消失,提示该患者血清中M蛋白为IgGκ型。

王大虎
王大虎

 

图5-23 IS-CZE对患者血清免疫分型结果

注:(1)为患者血清CZE图谱(对照图谱),显示特征性M蛋白峰,(2)~(6)为经抗体沉淀后的电泳图谱及对照图谱,其中(2)、(6)特征性M蛋白峰被吸收,与对照图谱比较明显降低,而(3)、(4)、(5)电泳图谱与对照图谱无明显变化,基本重合。

(资料来源:蒋最明,2008)

实例2:通过CE研究HIV抑制剂、Tat蛋白与RNA的相互作用

HIV Tat(trans-activitor of transcription)蛋白与HIV TAR(trans-activirtor response region)RNA的结合激活病毒转录这样一个关键环节,以HIV TAR RNA为新的靶标,设计新型HIV抑制剂(β-咔啉类药物),它可以与HIV-1Tat竞争,与HIV TAR RNA的特异部位结合,从而抑制转录的激活,使转录不能进行,从而阻止病毒复制。

(1)材料 β-咔啉类药物(Mr: 324)。

王大虎 (2)试剂 HIV Tat蛋白模型序列(Mr: 2297)和HIV TAR RNA模型序列(MW: 9188.4)(Sigma公司),其他试剂均为市售分析纯试剂。

(3)仪器 CE-212型毛细管电泳仪(北京大学Micro Analytical公司),λ214nm,数据由康志色谱工作站收集处理。毛细管(河北永年光导纤维厂)55cm(长度)×75µm(内径),有效分离长度47cm,毛细管温度约25℃。

(4)分离条件 缓冲液:50mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4(pH=8.0),使用前经0.45µm的微孔滤膜过滤。药物、蛋白质和RNA的溶液均由中性磷酸缓冲溶液(PBS,pH=7.4,c=10mmol/L,除菌)配制。运行电压:12kV,进样时间:10s。每次运行前,毛细管先用0.2mol/L的NaOH冲洗5min,再用去离子水冲洗2min,随后用缓冲溶液冲洗3min,然X样。每份样品均平行分析3次。

(5)结果分析 β-咔啉类药物结构及HIV Tat蛋白的模型序列和HIV TAR RNA的模型序列如图5-24所示。

 

图5-24 β-咔啉类药物的结构(1)和TAR RNA的模型序列(2)

注:A中R1—胍基(guanidine group),相对分子质量:324。

HIV Tat蛋白是具有86个氨基酸的多肽,所合成的模型序列为:丝氨酸、酪氨酸、甘氨酸、精氨酸、赖氨酸、赖氨酸、精氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、精氨酸、精氨酸、脯氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸。

由于蛋白质与RNA的特异作用,药物是以蛋白质为模板来设计的。理论上,药物与RNA的相互作用情况应和蛋白质与RNA的相互作用情况相似,并能与蛋白质相竞争,以达到抑制转录的激活。从图中可以看出,与游离时的峰面积相比,药物、蛋白质与RNA混合后各自的峰面积均明显减小,说明其和蛋白质与RNA的结合类似,药物与RNA也发生了结合作用(图5-25)。

 

图5-25 药物M、HIV Tat蛋白和HIV TAR RNA相互作用电泳图

1—HIV TAR RNA(1.07×10-4mol/L) 2—药物M(1.04×10-4mol/L)+TAR RNA

(1.07×10-4mol/L) 3—HIV Tat蛋白(2.0×10-5mol/L)+HIV TAR RNA

(1.07×10-4mol/L) 4—药物M(1.04×10-4mol/L)+HIV Tat蛋白

(2.0×10-5mol/L)+HIV TAR RNA(1.07×10-4mol/L)

5—药物M(1.04×10-4mol/L)+HIV Tat蛋白(2.0×10-5mol/L)

(1)HIV TAR RNA (2)HIV Tat蛋白 (3)药物M

(资料来源:齐小花,2005)

(三)手性分离

手性对映体分离、鉴定有巨大的应用价值,已成为医药领域内一个重要课题。常用的手性选择剂有环糊精及其衍生物、冠醚类、手性选择性金属络合物、胆酸盐、手性混合胶束和蛋白质等。CE进行手性分离时,通常在运行缓冲液内加入手性选择剂,在操作及分离效率上均优于HPLC手性分离。

实例:牛血清蛋白对手性物质的毛细管电泳拆分

(1)材料 牛血清蛋白(BSA)。

(2)试剂

①0.1mol/L Tris贮备液、0.1mol/L柠檬酸贮备液、5g/L的BSA贮备液。

②以上三种贮备液各取适量配成不同浓度、不同pH的并含适量乙醇或异丙醇的Tris-Cit运行缓冲液。

③各手性物质均用所运行的缓冲溶液配成1×10-4mol/L溶液供进样用。

(3)仪器 毛细管电导检测系统、石英毛细管柱59cm(长度)×50µm(内径)、毛细管电泳仪装置。

(4)实验步骤

①毛细管预处理:毛细管经0.1mol/L NaOH洗10min,用二次蒸馏水洗10min,放置过夜后通氮气于100℃条件下加热2h,自然冷却。

②物理吸附涂渍:将10%(质量分数)聚氧乙烯水溶液注X预处理柱中,在0.3MPa的氮气流下将涂渍液缓慢吹出,继续通氮气在室温下干燥。

③热固化涂渍:将10%(质量分数)聚氧乙烯水溶液注X预处理柱中,然后将毛细管放入140℃的气热鼓风干燥箱中加热5h,取出,冷却。在0.3MPa的氮气流下将残留的涂渍液缓慢吹出,再放入140℃的气热鼓风干燥箱中加热,干燥2h,取出,冷却。

④连接好毛细管电泳仪和检测装置,涂层毛细管在使用前依次用二次蒸馏水、运行缓冲溶液各冲洗5min。检测电极用超声波进行清洗。采用重力进样方式,进样高度差为20cm,时间为10s,操作电压18kV。电导率仪的输出信号经数据工作站采集,到微机中进行实时数据处理、图形显示和数据文件存储。实验在恒温(18℃)、恒湿(相对湿度75%)的实验条件下进行。

背景电解质:0.5g/L BSA+15mmol/L Tris+2.5mmol/L Cit(pH8.0);拆分多沙唑和沙丁胺醇所用的乙醇、异丙醇的量分别为2%和5%。

(5)实验结果 平性药物的电泳分离图如图5-26所示,拆分得到多沙唑嗪和沙丁胺醇。

 

图5-26 手性药物的电泳分离图

(1)R,S-沙丁胺醇 (2)R,S-多沙唑嗪

(资料来源:韦寿莲,2003)

发表评论

电子邮件地址不会被公开。 必填项已用*标注