大虎说事

第六章│色谱技术

色谱(chromatography)是一种分离的技术,随着现代化学技术的发展应运而生。20世纪初俄国的波兰植物化学家茨维特(Twseet)首先将植物提取物放入装有碳酸钙的玻璃管中,植物提取液由于在碳酸钙中的流速不同、分布不同,因此在玻璃管中呈现出不同的颜色,这样就可以对各种不同的植物提取液进行有效的成分分离。到1907年,茨维特的论文用俄文公开发表,他把这种方法命名为chromatography,即中文的色谱,这就是现代色谱这一名词的起源。

第一节 分子筛色谱

王大虎  一、基本原理

分子筛色谱又称凝胶排阻色谱、凝胶过滤和排阻层析,是20世纪60年代发展起来的一种新型的液相层析分离纯化方法。它的分离基础主要根据物质分子大小不同而进行。分子筛色谱所用的基质我们通常称之为凝胶,它是具有立体网状结构且呈珠状的颗粒物质,每个颗粒犹如一个筛子,当将混合物样品加入层析柱进行洗脱时,大分子物质不能进入基质内部而沿颗粒间的空隙随着溶剂流动,由于其流程较短,移动速度快而最先流出柱外;小分子物质则可以进入颗粒内部,不断地在不同的凝胶颗粒间进入与逸出,速度较慢,最后流出柱外;对于中等大小的分子来说,它们既能在凝胶颗粒内外分布,也能部分进入颗粒,从而在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。因此,利用分子筛色谱能使混合样品中大小不同的物质得到分离。

王大虎
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图6-1 分子筛色谱原理示意图

二、色谱柱重要参数

为了更好地说明分子筛色谱的原理,引入下列相关概念并辅以相应的图示,如图6-2和图6-3所示。

图6-2 柱容积示意图

图6-3 凝胶色谱洗脱曲线示意图

1—完全排阻的大分子 2—中等分子 3—完全渗透的小分子 4—吸附的分子

(1)柱体积 柱体积是指凝胶装柱后,从柱的底板到凝胶沉积表面的体积。在色谱柱中充满凝胶的部分称为凝胶床,因此柱体积又称“床”体积,常用Vt表示。Vt通常用磺基水杨酸、X铵、维生素B12、N-乙酰酪氨酸乙酯或者其他与凝胶无吸附力的小分子物质测定。

王大虎  (2)外水体积 色谱柱内凝胶颗粒间隙的体积称外水体积,也称间隙体积,用Vo表示。Vo经常用蓝色葡聚糖2000测定。

(3)内水体积 凝胶为三维网状结构,颗粒内部存在空间,液体可进入颗粒内部,这部分间隙的总和为内水体积,常用Vi表示,不包括固体支持物的体积(Vg)。

(4)洗脱体积 指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液的体积,常用Ve表示。一般情况,Ve的计算方式有以下三种:当加入样品的体积很少,与洗脱体积比较可以忽略不计时,在洗脱图中,从加样到峰尖位置所用洗脱液体积为Ve;当样品体积与洗脱体积比较不能忽略时,Ve可用样品体积的一半到峰尖位置所用的洗脱体积表示;当样品很大时,Ve则为样品开始到洗脱峰升高的弯曲点(或半高处)的洗脱体积。

任何一种物质在凝胶色谱柱中被排阻的范围均在0~100%,分离物在柱中的被排阻程度可用分配系数Kav来表示:

式中Ve——洗脱体积,mL;

Vo——外水体积,mL;

Vt——柱体积,mL;

Kav——分配系数。

很显然,在限定的条件下,上式中Vt和Vo都为恒定值,而Ve却是随着分离物分子质量的变化而变化的,即分子质量大,Kav值小;反之,则Kav值大,因而分子筛色谱可用来进行分子质量的测定。

凝胶色谱的分离效果除了受分子大小的影响外,还与分子的形状有关。

王大虎 三、分子筛色谱优缺点

分子筛色谱具有以下优点:

①操作简便:所需设备简单,有时只要有一根色谱柱便可进行工作。

②分离效果较好,重复性高:样品回收率高,接近100%。

③分离条件缓和:凝胶骨架亲水,分离过程又不涉及化学键的变化,蛋白质的活性不会受到影响。

④应用广泛:适用于各种生化物质,如多肽、激素、蛋白质、多糖、核酸的分离纯化、脱盐、浓缩以及分析测定等。分离的分子质量范围也很宽。

分子筛色谱的缺点如下:

①上样量少:在生物大分子物质的分离纯化操作中,一般不作为第一步的分离方法,而往往在后续处理中被使用。

②要求样品浓度、相对黏度不宜太高。

③分辨率不高,分离操作较慢。由于凝胶层析是以物质分子质量的不同作为分离依据的,分子质量的差异仅表现在流速的差异上,所以分离时流速必须严格把握。因而分离操作一般较慢。而且对于分子质量相差不多的物质难以达到很好的分离。

④凝胶颗粒对某些样品可能会产生非特异吸附,影响实验结果。

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