大虎说事

王大虎:平衡、上样与洗脱

1.缓冲液的选择

分子筛色谱不像其他色谱分离方式依赖于溶剂强度和选择性的改变来进行分离,在分子筛色谱中流动相只是起运载工具的作用,一般不依赖于流动相性质和组成的改变来提高分辨率。改变洗脱液的主要目的是为了消除组分与固定相的吸附等相互作用,所以和其他色谱方法相比,凝胶过滤洗脱液的选择不那么严格。洗脱液的选择主要取决于蛋白质的最适pH、溶剂组成、蛋白质抑制情况等,从而可以保持待分离目标分子的结构和功能。一般来说只要能溶解被洗脱物质,并不使其变性的缓冲液都可以用于凝胶过滤。

需注意的是,许多凝胶仍然残留剩余电荷。为了防止凝胶可能有吸附作用,一般洗脱液都含有一定浓度的盐,缓冲液的离子强度应该维持在0.15~2.0mol/L,以避免静电力或范德华力相互作用,从而得到理想的效果。如聚丙烯酰胺的交联可能降低凝胶的亲水性,导致一些低分子质量蛋白质和芳香族氨基酸残留,这些作用已经被用在某些情况下增强纯化效果,但是一般尽量避免这些作用影响分离效果。

王大虎 2.上样

凝胶柱经过充分平衡后可进行上样,一般说来上样体积,分析用量为柱床容积的1%~4%;制备用量为柱床容积的20%~30%。这样可使样品的洗脱体积小于样品各组分之间的分离体积,获得较满意的分离效果。加样时应尽量减少样品的稀释及凝胶床面的搅动。样品与柱床体积比例悬殊时分离效果好,但过少的样品量不但会造成设备和器材的浪费,降低工作效率,还会造成样品稀释。

由于凝胶色谱的稀释作用,似乎样品浓度应尽可能大才好,浓度受蛋白质的溶解度和黏度限制,但样品浓度过大往往导致黏度增大,而使分辨率下降(图6-4)。一般要求样品黏度小于0.01Pa·s,这样才不至于对分离造成明显影响。对蛋白质类样品浓度以不大于4%为宜,一般控制在2~20mg/mL。

 

图6-4 样品黏度对洗脱曲线的影响

(1)加蓝色葡聚糖2000,使终质量分数为5%,相对黏度11.8

(2)加蓝色葡聚糖2000,使终质量分数为2.5%,相对黏度4.2

(3)加蓝色葡聚糖2000,使终浓度为1%

(资料来源:X,2002)

洗脱液应与X溶液一致,更换溶剂,凝胶体积会发生变化,影响分离效果。洗脱液要有一定的离子强度和pH,例如分离血清蛋白常用0.02~0.1mol/L,pH6.9~8.0的PBS(0.14mol/L NaCl)和0.1mol/L,pH8.0的Tris-HCl缓冲盐溶液(0.14mol/L NaCl)。

王大虎 3.洗脱速度

洗脱速度也会影响凝胶过滤的分离效果(图6-5),一般洗脱速度要恒定而且合适。保持洗脱速度恒定通常有两种方法,一种是使用恒流泵,另一种是恒压重力洗脱。洗脱速度取决于很多因素,包括柱长、凝胶种类、颗粒大小等。洗脱速度慢一些,样品可以与凝胶基质充分平衡,分离效果好。但洗脱速度过慢会造成样品扩散加剧、区带变宽,反而会降低分辨率,而且实验时间会大大延长,所以实验中应根据实际情况来选择合适的洗脱速度,可以通过进行预备实验来选择洗脱速度。

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图6-5 洗脱速度对洗脱曲线的影响

(资料来源:X,2002)

4.收集

利用自动分步收集器收集,检测器和分布收集器之间距离应该尽量短,以保证检测器可以尽可能快地分析分布收集器收集的组分。

王大虎 (四)柱的再生和保存

1.柱的再生

生产厂家一般会提供凝胶再生的说明书。在洗脱过程中,所有组分一般都可被洗脱下来,所以装好柱后,可反复使用,无需特殊的再生处理。但多次使用后,凝胶颗粒可能逐渐沉积压紧,流速变慢。这时只需将凝胶自柱内倒出,重新填装。或使用反冲法,使凝胶松散冲起,然后自然沉降,形成新的柱床,这样流速会有所改善。

2.柱的保存

凝胶使用后,有几种保存方法:

(1)湿态保存 在水相中加防腐剂,或水洗到中性,高压灭菌封存或低温存放。

(2)半收缩保存 水洗后滤干,加70%乙醇使胶收缩,再浸泡于70%乙醇中保存。

(3)干燥保存 水洗后滤干,依次用50%、70%、90%、95%乙醇脱水,再用X洗去乙醇,干燥(或60~80℃烘干)后保存。加乙醇时,切忌一开始就用浓乙醇处理,以防结块。

王大虎 (五)柱效的评估

分离过程发生在液体向X动的时候。上样后,有一条样品带。为了考察柱效,可以将分离看作是在柱轴向上不连续区间发生的。每个区域是一个理论塔,区间的长度也称为理论塔的高(H)。H值是柱的物理参数,排阻限和操作条件等的函数(图6-6)。柱效取决于理论塔板数(N)。增加塔板数可以通过增加柱长实现。

 

 

图6-6 计算理论塔板高和测量柱性能

(资料来源:X,2002)

式中N——理论塔板数;

Ve——洗脱体积,mL;

W1/2——半峰宽,mL;

H——理论塔的高,cm;

L——柱高,cm。

如图6-7所示,可以通过峰的形状来判断分离是否成功,以及可能出现的问题,以便有针对性的改正。

 

图6-7 通过峰形状判断柱的性能

(资料来源:X,2002)

 

 

六、应用

 

分子筛色谱由于设备简单、操作方便、分离条件缓和以及分离效果好等特点,已经成为生物化学领域中一种重要的分离手段,广泛应用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的分离纯化,除此之外,还常用于生物大分子分子质量的测定、样品的脱盐等。

1.分离活性蛋白质

基于分子筛色谱的分离原理,对一些理化性质相似,但分子质量大小存在差异的分子来说,分子筛色谱是一种理想的选择。同时,这一方法具有操作简单、不改变样品生物学活性等优点,因而成为分离纯化蛋白质的一种重要手段。

从蓖麻种子中分离出来的毒蛋白具有很强的抑制蛋白质合成的功能和很强的细胞毒性,目前国内外学者竞相研究,其被广泛用于抗癌免疫毒素及生物农药的研究。其纯化的操作如下:

称取一定量去壳蓖麻籽,在5mmol/L PBS(pH6.5,含0.1mol/L NaCl,缓冲液A)中匀浆。匀浆液放置3~4h。用四层纱布滤去残渣,过滤后的溶液于15000r/min离心15min。小心除去沉淀和溶液表面的白色脂肪,取上清液。在上清液中加入固体X铵达到60%饱和度,放置2~3h,20000r/min离心20min。倒去上清液,把沉淀溶解在缓冲液A中,并用蒸馏水透析8h后于320000r/min离心20min,上清液即为蓖麻毒蛋白粗品(以上均在4℃下进行)。

Sepharose4B柱[2cm(内径)×24cm(长度)]用缓冲液A(pH6.5)平衡后,将粗提液过柱,先用同一缓冲液A洗脱除去杂蛋白,再用含100mmol/L D2半乳糖的磷酸缓冲液B洗脱,流速均为1mL/min,在λ=280nm处,得两个峰(图6-8),峰1为杂蛋白峰,收集峰2的流出液。Sephadex G-100凝胶过滤柱[2cm(内径)×40cm(长度)]用缓冲液A(pH6.5)平衡后,上图6-8中峰2的馏分,用缓冲液A洗脱,在λ=280nm处,得单一峰(图6-9)。收集图6-9中峰的流出液,经浓缩、透析、冷冻、干燥得到毒蛋白的冻干粉R。

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