王大虎

王大虎:蛋白质的复性

将一些对人类有用的蛋白质的基因利用基因工程的方法在宿主菌种中表达,但是,往往其表达活性太强,而且蛋白质不能及时排出细胞,所以导致多余的蛋白质以包涵体的形式存在于细胞中。为了获得有活性的蛋白质,必须先对包涵体进行变性和复性。对包涵体进行复性,凝胶色谱法与稀释复性相比,有成本低、效率高、对目的蛋白质有初步纯化效果等优点。

例如,程鏖等人利用凝胶过滤层析法对RGD-葡激酶进行复性,具体步骤如下:15mL变性蛋白,蛋白质浓度5.6mol/mL,上样于经复性缓冲液平衡好的Sephacry1S-100柱[3cm(内径)×100cm(长度)],洗脱复性液0.05mol/L PBS(pH7.4)以1mL/min流速洗脱复性,图6-12所示为RGD-Sak过Sephacry1S-100柱复性的紫外检测图,峰1经测A260和A280比值认为是核酸峰,峰2为RGD-Sak目标蛋白峰,峰3为盐峰。取3个峰尖样品进行SDS-PAGE,结果RGD-Sak主要集中在目标峰。收集的目标蛋白峰蛋白定量有52.3mg蛋白质,复性后蛋白质得率62%。经后续离子交换柱纯化得完全活性的RGD-Sak 39mg,复性率46.4%。

图6-12 RGD-葡激酶经凝胶过滤柱(SephacrylS-100)复性的洗脱图谱

(资料来源:程鏖,2002)

第二节 离子交换色谱

王大虎
王大虎

一、基本原理

离子交换色谱(ion exchange chromatography, IEC)是利用离子交换剂上的可交换离子与周围介质中各种带电荷离子间的电荷作用力不同,经过交换平衡达到分离目的的一种柱层析法。

IEC所用的色谱填料离子交换剂是人工合成的多聚物,由基质、电荷基团和反离子三部分构成(图6-13)。基质一般采用的是纤维素或葡聚糖凝胶等物质,通过酯化、醚化或氧化等化学反应,引入阳性或阴性离子基团的特殊制剂,因而,可与带相反电荷的化学物质进行交换吸附。离子交换剂在水中呈不溶解状态,能释放出反离子,同时与溶液中的其他离子或离子化合物相互结合吸附,结合后不会改变离子交换剂本身和被结合离子或离子化合物的理化性质。

图6-13 磺酸基纤维素离子交换剂组成示意图

根据离子交换剂上可电离基团(即反离子)所带电荷不同,可将离子交换剂分为阴离子交换剂和阳离子交换剂,反离子带电荷为正的(如Na+、H+)是阳离子交换剂,反离子带电荷为负的(如Cl-)是阴离子交换剂。含有欲被分离的离子的溶液通过离子交换柱时,各种离子即与离子交换剂上的荷电部位竞争性结合。任何离子通过柱时的移动速率决定于与离子交换剂的亲和力、电离程度和溶液中各种竞争性离子的性质和浓度。

离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物所进行的离子交换反应是可逆的。假定以RA代表阳离子交换剂,在溶液中解离出来的阳离子A+与溶液中的阳离子B+可发生可逆的交换反应,反应式如下:

该反应能以极快的速率达到平衡,平衡的移动遵循质量作用定律。

离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力,结合力的大小取决于离子交换剂的选择性。离子交换剂的选择性可用其反应的平衡常数K表示:

式中K——平衡常数;

[RB]——结合的B的浓度,mol/L;

[A+]——游离态A的浓度,mol/L;

[RA]——结合的A的浓度,mol/L;

[B+]——游离态B的浓度,mol/L。

如果反应溶液中[A+]等于[B+],则K=[RB]/[RA]。若K>1,即[RB]>[RA],表示离子交换剂对B+的结合力大于A+;若K=1,即[RB]=[RA],表示离子交换剂对A+和B+的结合力相同;若K<1,即[RB]<[RA],表示离子交换剂对B+的结合力小于A+。K值是反映离子交换剂对不同离子的结合力或选择性参数,故称K值为离子交换剂对A+和B+的选择系数。

阳离子交换剂对有机碱的选择性随着pKb的增大,亲和力增大,对两性化合物的选择性是随着等电点的增大,亲和力增大;阴离子交换剂对有机酸的选择性随着pKa的减小,亲和力增大,对两性化合物的来说,随着等电点的减小,亲和力增大。

溶液中的离子与交换剂上的离子进行交换,一般来说,电性越强越易交换。对于阳离子树脂,在常温常压的稀溶液中,交换量随交换离子的电价增大而增大,如Na+<Ca2+<Al3+<Si4+。若交换离子价数相同,交换量则随交换离子的原子序数的增加而增大,如Li+<Na+<K+<Pb+。

在稀溶液中,强碱性树脂的各负电性基团的离子结合力次序是:

弱碱性阴离子交换树脂对各负电性基团结合力的次序为:

两性物质如蛋白质、核苷酸、氨基酸等与离子交换剂的结合力,其等电点是离子交换层析进行的重要依据。在等电点处,分子的净电荷为零,与交换剂之间没有静电作用;当pH在其等电点以上时,分子带负电荷,可结合阴离子交换剂;当pH低于等电点时,分子带正电,可结合到阳离子交换剂。此外,在相同pH条件下,且等电点大于pH时,等电点越高,碱性越强,就越容易被阳离子交换剂吸附。因此通过溶液的pH对蛋白质的净电荷的影响可以达到分离纯化蛋白质的目的。

蛋白质分子与交换剂的结合是可逆的,用盐梯度或pH梯度可把吸附的蛋白质从柱上洗脱下来。其洗脱过程用图6-14简单表示如下。

图6-14 IEC原理示意图

1—平衡阶段:离子交换与反离子结合 2—吸附阶段:样品与反离子进行交换 3、4—用梯度缓冲液洗脱,先洗下弱吸附物质,而后洗下强吸附物质 5—再生阶段:用原始平衡缓冲液进行充分洗涤,即可重复使用

(资料来源:汪家政,2000)

 

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