王大虎

王大虎:缓冲液的选择

①对于两性蛋白质来说,缓冲液的pH决定蛋白质在该缓冲X下所带的净电荷。因此,缓冲液的选择应取决于目的蛋白的等电点、稳定性和溶解度,同时应兼顾交换剂解离基团的pK值。当蛋白样品属于碱性蛋白,欲采用阳离子交换剂时,选择的缓冲液pH应低于该物质的等电点;当蛋白样品属于酸性蛋白,采用阴离子交换剂时,则应选择的缓冲液pH要高于该物质的等电点(图6-16)。

图6-16 蛋白质的净电荷与pH的关系以及适于阴、阳离子交换剂的pH范围

(资料来源:李建武,2004)

②离子交换剂不仅与被分离的物质进行交换,同时也会与缓冲液中的离子发生交换,而离子交换剂的交换容量又有限。因此,起始缓冲液的浓度应尽可能低(一般应低于0.02mol/L),以保证目标物质能够尽可能被吸附。

③缓冲液离子应不影响被分离的目的蛋白或干扰其活性,同时,不应影响目标蛋白质的溶解度及其他的保护剂。

④常压层析操作往往所需较长的时间,易染菌。一般来说,使用阳离子交换剂时,可用0.02%叠氮钠或0.005%乙基汞硫代水杨酸作为防腐剂。

三、基本操作

整个IEC装置如图6-17所示。

图6-17 IEC装置示意图

(资料来源:汪家政,2000)

(一)交换剂的预处理、再生和转型

王大虎
王大虎

商品离子交换树脂为干树脂,要用水浸透使之充分吸水溶胀。又因含有一些水不溶性杂质,所以要用酸、碱处理除去。一般程序如下:干树脂用水浸泡溶胀,而后减压抽去气泡,倾去水,除去小颗粒,再用大量去离子水洗至澄清。去水后用0.1~1mol/L HCl溶液浸泡一段时间,除去酸液,用水洗至中性,再加0.1~1mol/L NaOH溶液浸泡一段时间,除去碱液,用水洗至中性备用。其中处理用的酸碱浓度对于不同实验条件可以有变动。

如果是亲水型离子交换剂,则要用0.5mol/L NaOH和0.5mol/L NaCl混合溶液或0.5mol/L HCl溶液处理,一般室温下处理30min。酸碱处理的次序决定了离子交换剂携带反离子的类型。在每次用酸或碱处理后,均应用水洗至近中性,再用碱或酸处理,最后用水洗至中性,经缓冲溶液平衡后即可使用或装柱。用过的离子交换剂使其恢复原状的方法,称为“再生”。再生时并非每次都用酸碱反复处理,往往只要转型处理就行。转型是采用一定的处理方式使交换剂带上所需类型的反离子。长期使用后的树脂含杂质很多,欲将其除掉,应先用沸水处理,然后用酸、碱处理。树脂若含有脂溶性杂质,可用乙醇或丙酮处理。长期使用后的亲水型离子交换剂的处理,一般只用酸、碱浸泡即可。对琼脂糖离子交换剂的处理,在使用前用蒸馏水漂洗,缓冲溶液平衡后即可。

(二)交换剂装柱

1.离子交换色谱柱

柱的高度依分离物质的不同而定,当所用的交换剂与待分离物质各组分之间的亲和力相差不多而需要交换剂的体积较大时,以增加柱长为宜,使待分离的组分被洗脱后再结合于交换剂上的概率增加,使性质相近的组分能较好地分离,因而增加了分辨率。柱的直径与高度的比以1∶20左右为宜。如采用离子强度较大的洗脱液梯度洗脱时,以选用粗而短的柱子为宜。因为当柱上洗脱液的离子强度高到足以完全取代被吸附的离子时,这些被置换的离子则以同洗脱液等速率从柱上向下移动,如果柱细长,即从脱附到流出之间的距离长,使脱附的离子扩散的机会增加,结果造成分离峰过宽,降低分辨率。用交联葡聚糖离子交换剂和纤维素离子交换剂时,常用的柱高为15~20cm。

2.装柱

色谱柱垂直固定,装柱时,先将色谱柱内加入一定高度的水,一般为柱长的1/3,转型再生好的交换剂先放入烧杯,加入少量水,边搅拌边倒入柱中,使交换剂缓慢沉降。交换剂在柱内必须分布均匀,不应有明显的分界线,严防气泡产生,否则将严重影响交换性能。为防止气泡和分线(即“断层”)的出现,再加入交换剂就可借水的浮力而缓慢沉降。同时控制排液口放水速率,以保持交换剂面上水的高度不变,交换剂就会连续地缓慢沉降,避免断层和气泡的产生。

离子交换剂的装柱量要依据其全部交换量和待吸附物质的总量来计算。当溶液含有各种杂质时,必须考虑使交换量留有充分余地,实际交换量只能按理论交换量的25%~50%计算。在样品纯度很低时,或有效成分与杂质的性质相近时,实际交换量应控制得更低些。

(三)样品上柱、洗脱和收集

1.上柱

装柱完毕,通过恒流泵加入缓冲溶液,对层析柱进行平衡,直至流出液的pH与起始缓冲溶液相同。关闭层析柱出液口,准备加样。

打开柱出液口,待缓冲溶液下移至柱床表面时,关闭出液口。用滴管加入已用起始缓冲溶液平衡后的样品。沿柱X缓慢滴加样品,待样品液加到一定高度后,再移向中央滴加,务必使样品液均匀分布于柱床全表面。然后打开出液口,待样品液全部流入柱床时,先用少量起始缓冲溶液冲洗柱X,再接上洗脱装置,按一定速率加入洗脱液,开始层析分离。

2.洗脱

IEC中的洗脱是至关重要的一步,从交换剂上把被吸附的物质洗脱下来,一种方法是增加离子强度,将被吸附的离子置换出来;另一种是改变pH,使被吸附离子解离度降低,从而减弱其对交换剂的亲和力而被脱附,如表6-5和图6-18所示。

表6-5 离子交换剂结合能力与盐浓度、pH改变的关系

图6-18 蛋白质的净电荷与pH的关系以及在阴、阳离子交换剂上的洗脱顺序

注:图中a、b、c分别表示常用的洗脱曲线变化图;a为分段洗脱,b为梯度洗脱,c为复合洗脱

常用的洗脱方式包括分段洗脱,梯度洗脱和复合洗脱,它们各自盐浓度曲线的变化如图6-19所示。

图6-19 几种洗脱方式盐浓度变化曲线示意图

(1)分段洗脱 有几个具有不相同洗脱能力的洗脱液相继洗脱[图6-19(1)]。这种方法适用于目标混合物组成简单或性质差别较大的情况。但这种方法分辨率较低,性质相近的混合成分难以分离,同时,由于目标分子所处的微环境的差异,使得同一种成分在恒定的洗脱条件下保留时间不同,从而容易产生拖尾现象。

(2)梯度洗脱 将不同的缓冲液混合,使流经色谱柱的洗脱液的洗脱能力呈梯度逐渐连续的增加[图6-19(2)]。这种方法使混合物各个组分依据性质的不同逐个进入解吸状态,大大提高了分辨率,同时,由于洗脱能力的连续性,避免了拖尾现象。为了有效地从交换剂上将各种被吸附的物质分阶段洗脱下来,常采用梯度溶液进行洗脱。常用的梯度混合器由两个容器构成(图6-20)。容器(1)放入起始缓冲液,容器(2)放入高盐浓度或pH的上限缓冲液,二者底部联通。容器(1)与色谱柱相连。当其中的缓冲液流入柱子时,容器(2)中的缓冲液会自动补足且借助磁力搅拌器混匀,这样就使得通入色谱柱的缓冲液的pH、离子强度呈线性增加,(1)、(2)两容器的相对大小可产生不同的梯度效果(图6-21)。

图6-20 梯度洗脱装置

(资料来源:汪家政,2000)

图6-21 梯度洗脱装置与梯度曲线类型

(资料来源:汪家政,2000)

(3)复合洗脱 它是将上述两种方式相结合的方法,一般我们会根据混合X蛋白质出峰的具体情况优化洗脱方式,使目标蛋白质快速有效地得到分离[图6-19(3)]。

由于被吸附的物质不一定是所要求的单一物质,因此除了正确选择洗脱液外,还采用控制流速和分部收集的方法来获得所需的单一物质。因不同物质的极性不同,容易交换的先流出来,根据先后顺序就能得到较纯的物质。

洗脱液的流速不仅与所用交换剂的结构、颗粒大小及数量有关,而且与层析柱的粗细及洗脱液的黏度有关,很难定出一定的标准,必须根据具体条件,反复实验,才能得出适合于特定层析条件的洗脱液流速,一般控制在5~8cm3/(cm2·h)。

3.收集

经洗脱流出的溶液可用部分收集器分部收集,收集的体积一般以柱体积的1%~2%为宜。若降低分部收集体积,可提高分辨率。分部收集洗脱液经相关的检测分析,便可得知所含物质的数量。也可以用监测仪显示收集的洗脱液在特定波长的吸光度(A)代表被分离物质的浓度,以此为纵坐标,以相应的洗脱体积为横坐标,绘制出洗脱曲线。

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