王大虎

王大虎:凝胶的类型及性质

王大虎 用于分子筛色谱的基质必须具备以下性质:

①必须是化学惰性的。基质颗粒本身和待分离物质之间不能发生化学反应。

②基质应具有稳定的化学性质。可在很大pH和温度范围使用,且在长期反复使用中保持化学稳定性。

③不带或只带有很少量的电荷,防止与蛋白质之间发生静电吸附。

能够符合这些性质起到分子筛作用的物质有很多,常见的包括琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、浮石、琼脂、葡聚糖凝胶等,以葡聚糖凝胶应用最广。常见胶的种类和性能见表6-1。

表6-1 胶的种类和性能

续表

(1)交联葡聚糖凝胶(Sephadex)

①Sephadex G:交联葡聚糖的商品名为Sephadex,不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示,G后面的阿拉伯数为凝胶吸水值的10倍。例如,G-25为每克凝胶X时吸水2.5g,而G-200为每克干凝胶X时吸水20g。交联葡聚糖凝胶的种类有G-10、G-15、G-25、G-50、G-75、G-100、G-150和G-200。因此,“G”反映了凝胶的交联程度、X程度及分布范围。

②Sephadex LH-20:Sephadex G-25的羧丙基衍生物,能溶于水及亲脂溶剂,用于分离不溶于水的物质。

(2)琼脂糖凝胶 琼脂糖凝胶的商品名很多,常见的有Sepharose(瑞典,pharmacia公司),Bio-Gel-A(美国,Bio-Rad公司)等。琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构,网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。一般情况下,它的结构是稳定的,可以在许多条件下使用(如水,pH4~9的盐溶液)。琼脂糖凝胶在40℃以上开始融化,也不能高压消毒,可用化学灭菌活处理。

王大虎  (3)聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成凝胶,是以丙烯酰胺为单位,由Bis交联成的,经干燥粉碎或加工成形制成粒状,控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。交联剂越多,孔隙越小。聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶-P(Bio-Gel P),由美国Bio-Rad公司生产,型号很多,从P-2~P-300共10种,P后面的数字再乘1000相当于该凝胶的排阻限度。

 

(4)聚苯乙烯凝胶 商品为Styrogel,具有大网孔结构,可用于分离相对分子质量1600~40000000的生物大分子,适用于有机多聚物相对分子质量测定和脂溶性天然物的分级,凝胶机械强度好,洗脱剂可用甲基亚砜。

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五、基本操作

(一)凝胶的选择与预处理

大虎说事 1.凝胶的选择

选择凝胶种类的依据是凝胶的性质、分离目的和层析物质分子质量的大小。依据分离目的不同可以将其分为:

①如果分离目的是将样品中的大分子物质和小分子物质分开,由于它们在分配系数上有显著差异,这种分离称组别分离,一般可选用Sephadex G-25;对于小肽和低分子质量的物质的脱盐可使用Sephadex G-10或G-15。

②如果分离目的是将样品中一些分子质量比较近似的物质进行分离,这种分离又称分级分离。一般选用排阻限度略大于样品中最高分子质量物质的凝胶,层析过程中这些物质都能不同程度地深入到凝胶内部,最后得到分离。

2.凝胶的预处理

凝胶多以干粉形式保存,使用前需用水或洗脱缓冲液充分溶胀。在室温下让其充分溶胀达到平衡,通常需要较长时间,一般要两天。较快的做法是将干胶往水里加,边加边搅,以防凝胶结块,然后放到沸水浴中接近100℃加热,几个小时就可以使其溶胀,还可起到除去颗粒内部气泡和杀菌作用。但溶胀过程中注意不要过分搅拌,以防颗粒破碎,并且凝胶要始终保持X。待溶胀平衡后用倾泻法除去不易沉下的细小颗粒,最后凝胶经减压抽气除去气泡,即可准备装柱。

王大虎  (二)凝胶柱的制备

大虎说事  1.凝胶柱的选择

分子筛色谱的分辨率取决于柱高。层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。纯化蛋白质时,柱床体积应为样品体积的25~100倍。除盐、游离荧光素时约为样品体积的4~10倍。柱太短,影响分离效果。柱长一些,分离效果好,但柱太长,则延长分离时间,样品也稀释过度。层析柱的内径也要选择适当。内径过细,会发生“器壁效应”,即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果。所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。对于除盐来说应为1∶5~1∶25;对于纯化蛋白质来说应为1∶20~1∶100。

连接柱的管子应该尽可能细和短,以避免区域扩散。柱必须可以承担分离时的操作压。流量适配器的使用可以调节不同的装柱体积,而且还可以减小死体积。

当用有机流动相、高盐或者变性剂操作时,对凝胶的要求十分严格。在使用凝胶时要按照生产厂家的说明使用。由于HPLC效率十分高,所以HPLC的凝胶柱比普通色谱柱短。虽然增加凝胶柱的长度可以得到较好的分离效果,但是,一般采用色谱柱串联的方法得到更好的结果。

王大虎  2.装柱

分子筛色谱装柱的要求特别高,装柱好坏直接影响分离的效果。柱子要求均匀、连续无断层、无气泡。将色谱柱垂直装好,关闭出口,在柱内先装入约1/3高度的水或缓冲液。装柱前需将凝胶上面过多的溶液倾出,然后将溶胀好的凝胶在搅拌成稀浆的情况下用玻璃棒引流,连续缓慢地倒入柱内,使其自然沉降,待凝胶沉降至柱高的1/4~1/3时,打开柱的出口,使凝胶继续沉积至需要的高度。如果条件允许,与柱配套的装柱池可以方便装柱。虽然装柱可以在重力作用下完成,但是更有效的方法是使用泵将缓冲液泵入柱中。装柱时的流速大概应该比操作流速高50%。装柱完成时在凝胶上面有明显的缓冲液分层,然后停止供液,将柱顶端剩余的缓冲液流出,最后在凝胶上方大约剩余2cm缓冲液。

柱装得不好往往造成洗脱区带加宽,甚至使一些本来可以分开的区带重叠。装柱时的操作压力太大,会使凝胶床压得太实,降低流速。

大虎说事 3.凝胶柱的鉴定

检验凝胶柱是否均匀,一般采用带有颜色的蓝色葡聚糖2000或红色葡聚糖溶液,将其过柱,观察色带是否均匀下降。如果色带狭窄、平整、均匀下降,说明凝胶均匀,能够使用,否则表明胶柱不均匀,断裂或有气泡,需重新制备。也可对光用X观察,应均匀、无纹路、无气泡。

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