大虎说事

王大虎:分离活性蛋白质

分子筛色谱由于设备简单、操作方便、分离条件缓和以及分离效果好等特点,已经成为生物化学领域中一种重要的分离手段,广泛应用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的分离纯化,除此之外,还常用于生物大分子分子质量的测定、样品的脱盐等。

基于分子筛色谱的分离原理,对一些理化性质相似,但分子质量大小存在差异的分子来说,分子筛色谱是一种理想的选择。同时,这一方法具有操作简单、不改变样品生物学活性等优点,因而成为分离纯化蛋白质的一种重要手段。

从蓖麻种子中分离出来的毒蛋白具有很强的抑制蛋白质合成的功能和很强的细胞毒性,目前国内外学者竞相研究,其被广泛用于抗癌免疫毒素及生物农药的研究。其纯化的操作如下:

王大虎  称取一定量去壳蓖麻籽,在5mmol/L PBS(pH6.5,含0.1mol/L NaCl,缓冲液A)中匀浆。匀浆液放置3~4h。用四层纱布滤去残渣,过滤后的溶液于15000r/min离心15min。小心除去沉淀和溶液表面的白色脂肪,取上清液。在上清液中加入固体X铵达到60%饱和度,放置2~3h,20000r/min离心20min。倒去上清液,把沉淀溶解在缓冲液A中,并用蒸馏水透析8h后于320000r/min离心20min,上清液即为蓖麻毒蛋白粗品(以上均在4℃下进行)。

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Sepharose4B柱[2cm(内径)×24cm(长度)]用缓冲液A(pH6.5)平衡后,将粗提液过柱,先用同一缓冲液A洗脱除去杂蛋白,再用含100mmol/L D2半乳糖的磷酸缓冲液B洗脱,流速均为1mL/min,在λ=280nm处,得两个峰(图6-8),峰1为杂蛋白峰,收集峰2的流出液。Sephadex G-100凝胶过滤柱[2cm(内径)×40cm(长度)]用缓冲液A(pH6.5)平衡后,上图6-8中峰2的馏分,用缓冲液A洗脱,在λ=280nm处,得单一峰(图6-9)。收集图6-9中峰的流出液,经浓缩、透析、冷冻、干燥得到毒蛋白的冻干粉R。

图6-8 蓖麻毒蛋白粗提液在Sepharose 4B柱上的层析分离

(资料来源:陆益民,2005)

图6-9 Sephadex G2100凝胶过滤色谱图

(资料来源:陆益民,2005)

王大虎  2.脱盐

由于盐类物质分子质量相对于蛋白质等生物大分子较小,通过凝胶排阻色谱柱时需要更长的时间,才能使其彼此分开来。凝胶柱脱盐不仅比透析快,而且大分子物质不会变性。一般用于这些操作的材料是细颗粒葡聚糖凝胶G-25。

3.测定相对分子质量

在一定的范围内,各个组分的Kav以及Ve与其相对分子质量的对数成线性关系:

式中Kav——分配系数;

Ve——洗脱体积,mL;

Mr——分子质量,u;

b,b’——斜率;

c——截距。

王大虎  由此通过对已知相对分子质量的标准物质进行洗脱,作出Ve或Kav对相对分子质量对数的标准曲线,然后在相同的条件下测定未知物的Ve或Kav,通过标准曲线即可求出其相对分子质量。凝胶过滤测定分子质量操作比较简单,所需样品量也较少,是一种初步测定蛋白分子质量的有效方法。这种方法的缺点是测量结果的准确性受很多因素影响。由于这种方法假定标准物或样品与凝胶都没有吸附作用,所以如果标准物或样品与凝胶有一定的吸附作用,那么测量的误差就会比较大。上面公式成立的条件是蛋白质基本是球形的,对于一些纤维蛋白等细长形状的蛋白不成立,所以凝胶过滤不能用于测定这类分子的分子质量;另外由于糖的水合作用较强,所以用凝胶过滤测定糖蛋白时,测定的分子质量偏大,而测定铁蛋白时则发现测定值小;还要注意的是标准蛋白和所测定的蛋白都要在凝胶过滤的线性范围之内。

将已知分子质量的标准物质在同一凝胶柱上以相同条件进行过滤层析。由于加入凝胶柱的物质分子质量不同,故洗脱体积也不同,根据洗脱体积求出Kav值,而Kav值与蛋白质分子质量之间又存在关系。因此,可以绘出一条标准曲线。在同样条件下,由未知分子质量物质的洗脱体积可求出其Kav值。以此值在标准曲线上就能求出其分子质量。用该方法测定分子质量,操作简便,需要样品量较少,故实用价值颇大。

以胰蛋白酶水解酪蛋白制备生物活性肽为例,利用凝胶层析法粗分离生物活性肽及测定其分子质量。将标准品蓝色葡聚糖凝胶2000、L-酪氨酸、维生素B12、溶菌酶、牛血清白蛋白配成5mg/mL的溶液,取样2mL上Sephadex G-15交联葡聚糖凝胶柱[1.7cm(内径)×57.5cm(长度)]。用缓冲液(浓度为0.05mol/L Tris-HCl,pH7.1)以1.7mL/min的速度进行洗脱,根据适当的洗脱体积测出其吸光度,绘制标准曲线,结果如图6-10所示。根据表6-2计算结果,以Kav值为横坐标,以lgM为纵坐标,绘制曲线如图6-11。因此,可得回归方程:lgM=4.82216-2.81531Kav,回归方程的相关系数为R=-0.99066,SD=0.18966,P=0.00934,说明Kav与lgM线性相关。因此,可以通过标准洗脱曲线回归方程来计算所分离肽的相对分子质量为:Mr=。

王大虎  图6-10 几种蛋白质标准品洗脱曲线

(资料来源:李培骏,2006)

表6-2 几种标准品在Sephadex G-15上的Kav值

图6-11 蛋白质的lgM与Kav的线性关系

注:图中各点由左向右依次是牛血清白蛋白、溶菌酶、维生素B12、L-酪氨酸

(资料来源:李培骏,2006)

王大虎  4.蛋白质的复性

将一些对人类有用的蛋白质的基因利用基因工程的方法在宿主菌种中表达,但是,往往其表达活性太强,而且蛋白质不能及时排出细胞,所以导致多余的蛋白质以包涵体的形式存在于细胞中。为了获得有活性的蛋白质,必须先对包涵体进行变性和复性。对包涵体进行复性,凝胶色谱法与稀释复性相比,有成本低、效率高、对目的蛋白质有初步纯化效果等优点。

例如,程鏖等人利用凝胶过滤层析法对RGD-葡激酶进行复性,具体步骤如下:15mL变性蛋白,蛋白质浓度5.6mol/mL,上样于经复性缓冲液平衡好的Sephacry1S-100柱[3cm(内径)×100cm(长度)],洗脱复性液0.05mol/L PBS(pH7.4)以1mL/min流速洗脱复性,图6-12所示为RGD-Sak过Sephacry1S-100柱复性的紫外检测图,峰1经测A260和A280比值认为是核酸峰,峰2为RGD-Sak目标蛋白峰,峰3为盐峰。取3个峰尖样品进行SDS-PAGE,结果RGD-Sak主要集中在目标峰。收集的目标蛋白峰蛋白定量有52.3mg蛋白质,复性后蛋白质得率62%。经后续离子交换柱纯化得完全活性的RGD-Sak 39mg,复性率46.4%。

图6-12 RGD-葡激酶经凝胶过滤柱(SephacrylS-100)复性的洗脱图谱

(资料来源:程鏖,2002)

 

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