王大虎

王大虎:离子交换剂类型及性质

王大虎 离子交换剂应具有高度的不溶性,保证在各种溶剂中不会发生溶解;具有稳定的理化性质,在使用过程中,离子交换剂不能因物理化学变化而发生分解;具有较多的交换基团;具有较大的表面积或疏松的孔状结构,确保交换离子X地发生扩散和交换。

(一)离子交换剂的类型

根据离子交换剂中基质的组成及性质,可将其分成两大类:疏水性离子交换剂和亲水性离子交换剂。

王大虎 1.疏水性离子交换剂

此类交换剂的基质是一种与水亲和力较小的人工合成树脂,最常见的是由苯乙烯与交联剂二乙烯苯反应生成的聚合物,在此结构中再以共价键引入不同的电荷基团。由于引入电荷基团的性质不同,又可分为阳离子交换树脂、阴离子交换树脂及螯合离子交换树脂。

(1)阳离子交换剂 阳离子交换剂的电荷基团带负电,反离子带正电,故此类交换剂可与溶液中的阳离子或带正电荷化合物进行交换反应。依据电荷基团的强弱,又可将它分为强酸型、中强酸型及弱酸型三种,各含有表6-3可解离基团。

表6-3 疏水性阳离子交换剂的电荷基团

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(2)阴离子交换剂 此类交换剂是在基质骨架上引入伯胺[—NH2]、仲胺[—NHCH3]、叔胺[—N(CH3)2]和季胺[—N+(CH3)3]基团后构成的,依据胺基碱性的强弱,可分为强碱性(含季胺基)、弱碱性(含叔胺、仲胺基)及中强碱性(既含强碱性基团又含弱碱性基团)三种阴离子交换剂。它们与溶液中的离子进行交换时,反应式为:

(3)螯合离子交换剂 这类离子交换树脂具有吸附(或络合)一些金属离子而排斥另一些离子的能力,可通过改变溶液的酸度提高其选择性。由于它的高选择性,只需用很短的树脂柱就可以把欲测的金属离子浓缩并洗脱下来。

疏水性离子交换剂由于含有大量的活性基团,交换容量大、流速快、机械强度大,主要用于分离无机离子、有机酸、核苷、核苷酸及氨基酸等小分子物质,也可用于从蛋白质溶液中除去表面活性剂(如SDS)、去垢剂(如曲拉通X—100)、尿素、两性电解质等。

王大虎 2.亲水性离子交换剂

亲水性离子交换剂中的基质为天然的或人工合成的化合物,与水亲和性较大,常用的有纤维素、交联葡聚糖及交联琼脂糖等。

(1)纤维素离子交换剂 纤维素离子交换剂或称离子交换纤维素,是以微晶纤维素为基质,再引入电荷基团构成的。根据引入电荷基团的性质,也可分强酸性、弱酸性、强碱性及弱碱性离子交换剂。纤维素离子交换剂中,最为广泛使用的是二乙胺基乙基(DEAE-)纤维素和羧甲基(CM-)纤维素。近年来Pharmacia公司用微晶纤维素经交联作用,制成了类似凝胶的珠状弱碱性离子交换剂(DEAE-Sephacel),结构与DEAE-纤维素相同,对蛋白质、核酸、激素及其他生物聚合物都有同等的分辨率。目前常用的纤维素交换剂如表6-4所示。离子交换纤维素适用于分离大分子多价电解质。它具有疏松的微结构,对生物高分子物质(如蛋白质和核酸分子)有较大的穿透性;表面积大,因而有较大的吸附容量。基质是亲水性的,避免了疏水性反应对蛋白质分离的干扰;电荷密度较低,与蛋白质分子结合不牢固,在温和洗脱条件下即可达到分离的目的,不会引起蛋白质的变性。但纤维素分子中只有一小部分羟基被取代,结合在其分子上的解离基团数量不多,故交换容量小,仅为交换树脂的1/10左右。

表6-4 离子交换纤维素

 

王大虎 (2)交联葡聚糖离子交换剂 交联葡聚糖离子交换剂是以交联葡聚糖G-25和G-50为基质,通过化学方法引入电荷基团而制成的。其中交换剂G-50型适用于相对分子质量为3×104~2×105的物质的分离,交换剂G-25型能交换相对分子质量较小(1×103~5×103)的蛋白质。交联葡聚糖离子交换剂的性质与葡聚糖凝胶很相似,在强酸和强碱中不稳定,在pH=7时可耐120℃的高热。它既有离子交换作用,又有分子筛性质,可根据分子大小对生物高分子物质进行分级分离,但不适用于分级分离相对分子质量超过2×105的蛋白质。

(3)琼脂糖离子交换剂 主要是以交联琼脂糖CL-6B(Sepharose CL-6B)为基质,引入电荷基团而构成。这种离子交换凝胶对pH及温度的变化均较稳定,可在pH3~10和0~70℃范围内使用,改变离子强度或pH时,床体积变化不大。例如,DEAE-Sepharose CL-6B为阴离子交换剂;CM-Sepharose CL-6B为阳离子交换剂。它们的外形呈珠状,网孔大,特别适用于相对分子质量大的蛋白质和核酸等化合物的分离,即使加快流速,也不影响分辨率。

(二)离子交换剂及缓冲液的选择

王大虎 1.离子交换剂的选择

应用IEC技术分离物质时,选择理想的离子交换剂是提高得率和分辨率的重要环节。任何一种离子交换剂都不可能适用于所有的样品物质的分离,因此必须根据各类离子交换剂的性质以及待分离物质的理化性质,选择一种最理想的离子交换剂进行层析分离。选择离子交换剂的一般原则如下:

①选择阴离子或阳离子交换剂,决定于被分离物质所带的电荷性质。如果被分离物质带正电荷,应选择阳离子交换剂;如带负电荷,应选择阴离子交换剂;如被分离物为两性离子,则一般应根据其在稳定pH范围内所带电荷的性质来选择交换剂的种类。

蛋白质属于两性电解质,所带电荷取决于所处缓冲液的pH大小。当蛋白质等电点大于其所在缓冲液pH时,蛋白质带正电荷,应选用阳离子交换剂;当蛋白质等电点小于其所在缓冲液pH时,蛋白质带负电荷,应选用阴离子交换剂。

②强型离子交换剂适用的pH范围很广,所以常用它来制备去离子水和分离一些在极端pH溶液中解离且较稳定的物质。弱型离子交换剂适用的pH范围狭窄,在pH为中性的溶液中交换容量高,用它分离生命大分子物质时,其活性不易丧失。强酸性阳离子交换树脂虽然可与很多阳离子交换,但对正电荷的胶体和高分子阳离子都不易吸附或吸附很少,所以一般用弱酸性树脂分离碱性蛋白质。强、弱型离子交换剂的交换容量与适用pH范围的比较如图6-15所示。

 

图6-15 强、弱型离子交换剂的交换容量以及适用pH范围的比较

强离子:(1)QS epharoseTM Fast Flow (2)SP Sepharose Fast Flow

弱离子:(3)DEAE Sepharose Fast Flow (4)CM Sepharose Fast Flow

(资料来源:汪家政,2000)

③离子交换剂处于电中性时常带有一定的反离子,使用时选择何种离子交换剂,取决于交换剂对各种反离子的结合力。为了提高交换容量,一般应选择结合力较小的反离子。据此,强酸型和强碱型离子交换剂应分别选择H型和OH型;弱酸型和弱碱型交换剂应分别选择Na型和Cl型。

④交换剂的基质是疏水性还是亲水性,对被分离物质有不同的作用性质(如吸附、分子筛、离子或非离子的作用力等),因此对被分离物质的稳定性和分离效果均有影响。一般认为,在分离生命大分子物质时,选用亲水性基质的交换剂较为合适,它们对被分离物质的吸附和洗脱都比较温和,生物活性不易破坏。

⑤交联度:离子交换剂中的基质是通过交联剂交联而制成的,不同离子交换剂中交联剂类型是不同的,如树脂的交联剂用二乙烯苯;纤维素基质的交联剂为3-氯代-1,2-环氧丙烷;琼脂糖基质中的交联剂为2,3-二溴丙醇。

一般遵循分子质量较大的物质选择交联度低的交换介质,性质相似的小分子物质选择交联度大的介质。

⑥交换容量:交换容量指离子交换剂与溶液中离子或离子化合物进行交换的能力,通常选用交换容量大的介质。

⑦交换速度:一般情况,选用交换速度快的介质。

2.缓冲液的选择

①对于两性蛋白质来说,缓冲液的pH决定蛋白质在该缓冲X下所带的净电荷。因此,缓冲液的选择应取决于目的蛋白的等电点、稳定性和溶解度,同时应兼顾交换剂解离基团的pK值。当蛋白样品属于碱性蛋白,欲采用阳离子交换剂时,选择的缓冲液pH应低于该物质的等电点;当蛋白样品属于酸性蛋白,采用阴离子交换剂时,则应选择的缓冲液pH要高于该物质的等电点(图6-16)。

 

图6-16 蛋白质的净电荷与pH的关系以及适于阴、阳离子交换剂的pH范围

(资料来源:李建武,2004)

②离子交换剂不仅与被分离的物质进行交换,同时也会与缓冲液中的离子发生交换,而离子交换剂的交换容量又有限。因此,起始缓冲液的浓度应尽可能低(一般应低于0.02mol/L),以保证目标物质能够尽可能被吸附。

③缓冲液离子应不影响被分离的目的蛋白或干扰其活性,同时,不应影响目标蛋白质的溶解度及其他的保护剂。

④常压层析操作往往所需较长的时间,易染菌。一般来说,使用阳离子交换剂时,可用0.02%叠氮钠或0.005%乙基汞硫代水杨酸作为防腐剂。

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