王大虎

王大虎:蛋白质等电点测定

王大虎 测定蛋白质等电点比较经典的方法是利用IEF。采用IEC测定蛋白质等电点的依据是蛋白质与交换剂间的结合力随pH的改变而改变。其操作步骤包括:

①取一定量的强性离子交换剂(如SP-Sephadex C-50或QAE-Sephadex A-50)用蒸馏水进行X、漂洗。

②精确称取等质量的湿胶若干份,分别装入试管中,用不同的pH洗涤5~10次,离心除去上清液。

③于处理好的胶中分别加入样品,反应10min。离心,取上清液加适量高浓度的缓冲液,使各管的pH一致,测定吸光度(A280)或活力单位。

④以吸光度为纵坐标,pH为横坐标作图,根据截距b和斜率m,测出未知样品的最高吸光度所对应的pH(YH)和最低吸光度所对应的pH(YL),则

式中PI——等电点;

YH——未知样品的最高吸光度对应pH;

YL——未知样品的最高吸光度对应pH;

b——截距;

m——斜率。

王大虎 一般情况,为了简便计算,我们采用:

X等利用此方法对饭豇豆凝集素等电点进行了测定:所采用的交换剂为SP-Sephadex C-50强阳离子交换剂;40mmol/L PBS,pH3.5~8.0(间隔0.2pH单位);凝集素样品浓度2mg/mL。凝集素与SP-Sephadex C-50充分反应后,测定上清液凝集羊红细胞的量作为活力单位。测定结果所得到的图谱如图6-24所示,则得到凝集素的等电点:pI=(5.2+5.4)/2=5.3。

图6-24 饭豇豆凝集素等电点测定图谱

(资料来源:X,1998)

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王大虎 第三节 亲和色谱

亲和色谱(Affinity Chromatography)(也称亲和层析)是利用生物分子间专一的亲和力而进行分离的一类层析技术。生物大分子物质能和某些相对应的分子专一而可逆地结合,例如我们所熟知的酶与底物或抑制剂、抗原与抗体、激素与受体等,利用这种性质可以实现对生物分子进行分离纯化。20世纪60年代末,溴化氰(CNBr)活化多糖凝胶并偶联蛋白质技术的出现,能够将配体固定化,使得亲和层析技术得到了快速的发展。亲和层析包含各种形式,所使用的配基可以是一个肽、一个抗体、一个底物或金属离子,还可以用凝集素、染料等。但其共同特征均以蛋白质和介质上的配基间的亲和力为基础,亲和层析就是利用不同蛋白质与各种配基结合能力不同,从而达到分离的一种纯化方法。亲和层析是分离纯化蛋白质、酶等生物大分子最为特异而有效的层析技术,其分离过程简单、快速,具有很高的分辨率,在生物分离中有广泛的应用。

 

 

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