大虎说事

王大虎:亲和色谱基本概论

王大虎 (一)基本原理

生物分子间存在很多特异性的相互作用,例如抗原-抗体、酶-底物或抑制剂、激素-受体等,它们之间都能够专一而可逆的结合,这种结合力就称为亲和力。亲和层析是利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力,从而达到分离的目的的一类特殊层析技术,原理如图6-25所示。被固定在基质上的分子称为配体,配体和基质是共价结合的,构成亲和层析的固定相,称为亲和吸附剂。在亲和层析中,特异的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力,并产生复合物。实质上是把具有识别能力的配体L以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M(如活化琼脂糖等)上,制成亲和吸附剂M-L,或者叫做固相载体。而固化后的配体仍保持束缚特异物质的能力。因此,当把固相载体装入小层析柱(几毫升到几十毫升床体积)后,把欲分离的样品液通过该柱。这时样品中对配体有亲和力的物质S就可借助静电引力、范德华力,以及结构互补效应等作用力吸附到固相载体上,而无亲和力或非特异吸附的物质则被起始缓冲液洗涤出来,并形成了第一个层析峰。然后,恰当地改变起始缓冲液的pH、或增加离子强度、或加入抑制剂等因子,即可把物质S从固相载体上解离下来,并形成了第M个层析峰。如果样品液中存在两个以上的物质与固相载体具有亲和力(其大小有差异)时,采用选择性缓冲液进行洗脱,也可以将它们分离开(图6-26)。

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图6-25 亲和层析分离原理

(资料来源:李建武,2004)

图6-26 亲和层析基本过程

(1)可逆结合的生物分子 (2)基质与配基偶联 (3)亲和吸附 (4)洗脱

(资料来源:X,2002)

(二)亲和吸附剂

选择并制备合适的亲和吸附剂是亲和层析的关键步骤之一。它包括基质和配体的选择、基质的活化、配体与基质的偶联等。

1.基质的选择

基质是构成固定相的骨架,亲和层析的基质应该具有以下性质:

①基质本身与目标样品组分均没有明显的非特异性吸附,不影响配体与待分离物的结合。

②具有较多的化学活性基团,易于活化,并且结合后不改变基质和配体的基本性质。

③基质的结构应是稀疏而均匀的多孔网状结构,以使被分离的生物分子能够均匀、稳定的通过,并充分与配体结合,基质的孔径过小会增加基质的排阻效应,使被分离物与配体结合的几率下降,降低亲和层析的吸附容量。

④稳定的理化性质。在与配体偶联、层析过程中,配体与待分离物结合以及洗脱时的pH、离子强度等条件下,基质的性质不会发生明显的改变。

⑤基质应具有高度的亲水性,确保生物分子与配体接近并发生作用。

亲和层析使用的基质有纤维素、交联葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺、多孔玻璃珠等用于分子筛色谱的凝胶。纤维素价格低,可利用的活性基团较多,但它对蛋白质等生物分子有明显的非特异性吸附作用,且结构不均一,稳定性较差。交联葡聚糖和聚丙烯酰胺的物理化学稳定性较好,但它们的孔径相对比较小,与配体偶联后多孔性还会有较大的降低,不利于待分离物与配体充分结合。多孔玻璃珠的特点是机械强度好,化学稳定性好。但它对蛋白质等生物分子有一定的吸附作用,而且活性基团较少。琼脂糖凝胶则基本可以较好地满足上述的条件,它具有非特异性吸附作用低、稳定性好、孔径均匀适当、易于活化等优点,因此得到了广泛的应用,如Pharmacia公司的Sepharose-4B和Sepharose-6B是目前应用较多的基质。

2.配体的选择

可选择的配体有很多种,但应具有以下条件:

①与待分离的物质要有较强的亲和力。一般来说,配体与大分子物质间的亲和力越大越好。

②与待分离的物质之间的亲和力应具有可逆性,保证一定的方法能够使它们解离,且不会破坏目标蛋白质的生物活性。

③具有与基质稳定结合的共价基团,与基质偶联后,对其与目标蛋白质间的亲和性没有影响或影响较小。

亲和层析配体的选择非常重要,可选择的配体包括抗体、激素、抑制剂、辅酶、辅基、类似底物,此外,外源凝集素、染料、金属离子也可以作为配体,如表6-6所示。一般来说,根据待分离的生物大分子在溶液中与一些物质作用亲和力的大小和专一性情况进行选择。例如,纯化酶可以选择酶的抑制剂、底物、辅酶作配基;纯化糖蛋白可选用凝集素;纯化激素受体蛋白选择相应的激素作受体。

表6-6 亲和层析所用X

 

3.亲和吸附剂的制备

亲和吸附剂的制备包括两部分:①基质的活化;②配基与活化基质的偶联。基质的活化是指通过对基质进行一定的化学处理,使基质表面上的一些化学基团转变为易于和特定配体结合的活性基团,常见的偶联基团见表6-7。偶联指的是将配基共价结合到基质上。由于基质性质的不同,活化及偶联的方法也具有差异。常见的几种基质活化及偶联的方法简单介绍如下。

表6-7 与基质共价偶联的功能团

 

(1)多糖类基质亲和吸附剂的制备 多糖类基质活化及偶联的方法有很多,如:CNRr、双环氧、N-羟基琥珀酰亚胺、三嗪、高碘酸盐、羰酰二咪唑、乙二酸酰肼、二乙烯砜等。其中以CNBr和双环氧的方法最为常用。

①CNBr活化及偶联法:CNBr活化法是最常用的方法之一。具体操作为:琼脂糖凝胶依次用0.1mol/L NaCl和水洗涤,然后加入等量的蒸馏水和2mol/L Na2CO3(pH11~12),混匀,加入少量冰块维持低温。称取CNBr(50~300mg/g贮存胶)溶于二甲基甲酰胺溶液中。将此液迅速加到琼脂糖悬浮液中进行活化,并使pH始终维持在11~12,温度控制在30℃,约10min后,加入大量碎冰,使反应X尽快冷却到4℃或更低的温度。将凝胶过滤,用5~10倍冷的蒸馏水洗涤,由于活化的琼脂糖凝胶在碱性条件下极不稳定,整个过程应尽快完成。接下来用偶联所需的缓冲液洗涤,立即将胶放入含有配基的缓冲液中,4℃下缓慢搅拌反应12h。偶联后,为了避免非特异吸附,应除去残留的活化基团,可在凝胶的水溶液中加入乙醇胺,搅拌10h,用水、2mol/L KCl依次洗涤,再用水除去KCl。

这种方法结合的配体量大,但缺点是CNBr活化法的基质和配体偶联后生成的异脲衍生物中氨基的pKa=10.4,所以通常会带一定的正电荷,从而使基质可能有阴离子离子交换作用,增大了非特异性吸附,影响亲和层析的分辨率。另外CNBr活化的基质与配体结合不够稳定,尤其是当与小配体结合时,可能会出现配体脱落现象。

②双环氧活化及偶联法:这类方法活化后的基质都含有环氧乙烷基,是另一种较常用的方法,虽然偶联的配基量不及CNBr活化时多,但反应比较温和,且在活化过程不会产生新的电荷。

操作方法:取1g琼脂糖凝胶,悬浮于1mL 1,4-丁二醇-2-缩水甘油醚中,加入含2mg硼氢化钠(NaBH4)的0.6mol/L NaOH 1mL,混匀,25℃反应8h,用500mL蒸馏水充分洗涤以停止反应,得到环氧琼脂糖。将它加入含有2mL偶联缓冲液中,如配基是蛋白质,则在pH8.5~10、25℃条件下反应15~48h;如配基是氨基酸、胺、糖或其他稳定的物质,则选择在pH9~11,25~75℃条件下反应4~15h,pH和温度越高,偶联量越多,此外,增加反应时间也会提高偶联量。

(2)聚丙烯酰胺基质亲和吸附剂的制备 聚丙烯酰胺凝胶有大量的甲酰胺基,可以通过对甲酰胺基的修饰而对聚丙烯酰胺凝胶进行活化。一般有以下三种方式:氨乙基化作用、肼解作用和碱解作用。另外在偶联蛋白质配体时也通常用戊二醛活化聚丙烯酰胺凝胶。

①氨乙基化作用:干的珠状聚丙烯酰胺凝胶在搅拌下,逐渐加入到已预热至90℃的无水乙二胺中,1g的干胶用20mL的乙二胺,反应后用等体积的冰水冷却,凝胶用0.2mol/L NaCl0.001mol/L HCl溶液充分洗涤。

②肼解作用:干的珠状聚丙烯酰胺凝胶在搅拌下,加入到肼的水溶液中(1~6mol/L),在一定温度下再继续缓慢搅拌一段时间,用大量的0.2mol/L NaCl洗涤以终止反应。所得活化基团数目是由肼的浓度、反应温度和时间决定的。

③碱解作用:干的珠状聚丙烯酰胺凝胶在搅拌下,加入到0.5mol/L Na2CO3及0.5mol/L NaHCO3的混合液中(pH10.0或10.5),混合液的体积多于溶胀胶的体积,搅拌30min,凝胶迅速加热到60℃,并维持一段时间,期间需不断搅拌,随后冰浴冷却,用0.2mol/L NaCl充分洗涤。所得活性基团数目由加热时间控制,时间越长,活化基团越多。此外,与溶液的pH也有关系,应控制在pH10.0~10.5。

(3)多孔玻璃珠基质亲和吸附剂的制备 对于多孔玻璃珠等无机凝胶的活化通常采用硅烷化试剂与玻璃反应生成烷基胺-玻璃,在多孔玻璃上引进氨基,再通过这些氨基进一步反应引入活性基团,与适当的配体偶联(表6-8)。

表6-8 亲和层析偶联试剂

 

载体先在5%AgNO3溶液中煮沸45min,然后用水洗涤,在120℃下烘干,1g干的基质加入75mL、10%的γ-氨丙基三乙氧基硅烷,溶解在甲苯中回流12~24h,用甲苯、丙酮洗涤,空气干燥,所得产物含有烷氨基的功能团。

(4)间隔臂分子在亲和层析中,配基在与待分离的生物大分子结合时,很大程度上要受到基质和待分离的生物大分子间的空间位阻效应的影响。尤其是当分子质量较小的配体、亲和力低的蛋白质分子配基和待分离的生物分子质量较大时,由于直接结合在基质上的小分子配体非常靠近基质,而待分离的生物大分子由于受到基质的空间障碍,使得其与配体结合的部位无法接近配体,影响了待分离的生物大分子与配体的结合,造成吸附量的降低。解决这一问题的方法通常是在配体和基质之间引入适当长度的“间隔臂”,即加入一段有机分子,使基质上的配体离开基质的骨架向外扩展伸长,这样就可以减少空间位阻效应,大大增加配体对待分离的生物大分子的吸附效率。加入间隔臂的长度要恰当,太短则效果不明显;太长则容易造成弯曲,反而降低吸附效率。

引入间隔臂分子常用的方法是将适当长度的氨基化合物NH2(CH2)nR共价结合到活化的基质上,R通常是氨基或羧基,n一般为2~12。例如Pharmacia公司生产的AH-Sepharose 4B和CH-Sepharose 4B就是分别将1,6-乙二胺和6-氨基乙酸与CNBr活化的琼脂糖反应引入间隔臂分子。两者的末端分别为氨基或羧基,通过碳二亚胺的缩合作用可以分别与含羧基或氨基的配体偶联。

(5)配体结合量的测定 配体与基质偶联后,通常要测定配体的结合量以了解其与基质的偶联情况,同时也可以推断亲和层析过程中对待分离的生物大分子吸附容量。配体结合量通常是用每毫升或每克基质结合的配体的量来表示。测定配体结合量的方法很多,下面介绍几种常用的测定方法。

①差量分析:根据加入配体的总量减去配体与基质偶联后洗涤出来的量即可大致推算出配体的结合量。当配体可以用光谱法准确定量时,这种方法还是相当准确的。

②直接光谱测量:对于能够吸收250nm以上波长的配体,可以直接用光谱法测定与基质结合的配体的量。

③凝胶溶解:通过适当的方法将凝胶溶解,如75℃下与酸或碱作用,而后直接用光谱法测量。

④酸或酶的水解:用酸或酶作用,使得基质释放出配体或配体的裂解物进行分析。

⑤2,4,6-三硝基苯磺酸钠(TNBS)分析:利用TNBS与未结合配体和结合某些配体的基质作用呈现不同的颜色,可以计算出配体结合量。

⑥元素分析:如果配体中含有某种特别的元素,通过元素分析就可以确定配体结合量。

⑦放射性分析法:偶联中加入一定量带有同位素的配体,通过放射性分析确定配体结合量,这是一种非常灵敏的方法。

影响配体结合量的因素很多,包括基质和配体的性质、基质的活化方法及条件、基质和配体偶联反应的条件等。实验中通常希望配体结合量较高,但应注意增加配体结合量应根据实际情况而定,还要考虑到其他因素的影响。因为提高配体的结合量不等于提高亲和吸附剂的吸附容量,配体结合量只是影响亲和吸附剂吸附容量的一个因素,还有很多因素,如基质、配体以及待分离物质本身的性质、配体与基质的结合情况以及后面要介绍的实验操作条件等都可能对亲和吸附剂的吸附容量产生很大的影响。例如增大配体的结合量通常可以增加吸附容量,但有些增大配体结合量的条件可能会影响配体的结构,降低配体和待分离物质的亲和力,这样反而会降低亲和吸附剂的吸附容量。实际上影响亲和吸附剂吸附容量的因素是非常复杂的,要获得较高的吸附容量往往要考虑很多因素,并通过实验摸索来选择合适的条件。

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