王大虎

王大虎:染色配基体亲和色谱

王大虎(一)基本原理

染色配基体亲和色谱,也称染料亲和层析,是在活性染料能够选择、可逆地结合蛋白质的基础上建立起来的色谱方法。

三嗪染料是一种反应性染料,它包括三个部分,即活性三嗪环(用于与载体偶联)、多芳香环和离子性磺酸基团。作为亲和层析而言,三嗪染料分为两类,一类是二氯三嗪染料,它的三嗪环上有两个氯,较为活泼,在室温下就可以与适当的载体偶联;另一类是一氯三嗪染料,它是前者的一个氯被一些功能基团取代而得,一氯染料的反应性稍低,在亲和层析中特别是HPLC中,一般先要将取代氯转变为6-氨己基衍生物,然后再与载体连接。

当三嗪染料存在于分离X中时,许多蛋白质都表现出不同的行为。后来发现,这是因为三嗪染料基团的生色团对某些蛋白质起亲和作用。因此,以染料作为配基的所谓“基团特异性”或“一般配基”亲和层析很快被人们所认识并得到广泛应用,成为蛋白质纯化的一种有利工具。近年来,HPLC的出现使它在生物大分子物质的分离纯化中显示出更大的潜力。

固定化蓝色染料核酸辅酶相似因子(Cibacron Blue F3G-A,CB)能够结合40多种酶和蛋白质,包括:以NAD+、NADP为辅酶的氧化还原酶、与辅酶A有关的酶、磷酸激酶、水解酶、RNA和DNA的核酸酶和聚合酶、糖解酶、磷酸二酯酶、脱羧酶以及一些血液蛋白和干扰素等。含有NAD+相似结构的辅酶的染料是通过竞争性作用机制洗涤蛋白质的,染料竞争性地与底物的反应基团结合,其配基位点通过静电作用、疏水作用结合蛋白质。通过改变配基,使之与成功纯化脱氢酶和蛋白酶的配基相似,从而提高染料配基的亲和能力。

洗脱结合蛋白通常运用提高离子浓度或者是使用一种竞争性的配基(如结构类似物)的方法。提取哺乳动物具有不同功能的CoA合酶的优化方法是这两种方法相结合。在实践中人们发现商品染料配基对目标蛋白质的选择性通常较低,因而科研人员寻求通过改变染料的官能团和结构来提高染料配基对目标分子的专一性。例如,将碱性磷酸酶(AKP)的抑制剂磷酸和胂酸的衍生物引入到Cibacron Blue F3G-A中用以纯化AKP,大大提高了配基的选择性。这一成功使人们将更多的注意力转移到研究配基与目标蛋白质之间相互作用的机理上,从而设计出具有高选择性的配基。

王大虎 (二)固定相制备方法

1.间隔臂

最初制备三嗪染料亲和材料,是用染料与基质直接偶联而得。后来发现,在三嗪染料与基质之间插入一间隔分子,不但使反应易于进行,更重要的是可以增加分离蛋白质的选择性。软基质常用葡聚糖、己糖和聚乙亚胺基等作为间隔分子。

2.配体与基质的连接

三嗪染料与软基质的连接方法通常有两种:一种是通过基质上或间隔臂上的羟基与染料三嗪环上的氯原子反应。第二种方法是三嗪染料蒽醌环上的氨基与溴化氰或N-羟基琥珀酰亚胺活化的琼脂糖等连接,其缺点是三嗪环没有纯化,可能与蛋白质发生不可逆反应。

(三)操作条件

层析分离受着诸多因素的影响,如柱子形状、流速、进样体积等,在这些方面染料亲和色谱与生物特异性亲和色谱基本相同。

王大虎
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1.染料的选择

目前大量使用的三嗪染料可用来纯化:①吡啶核苷酸依赖的脱氢酶。②各种激酶,包括水解酶、乙酰基转移酶、磷酸水解转移酶、RNA和DNA核酸酶和限制性核酸内切酶等。③肌球蛋白,各种血红蛋白及干扰素等。比较三嗪染料和Procion Red HE-3B,前者适于纯化NAD+依赖的脱氢酶,后者对NADP依赖的脱氢酶则更有亲和性。

2.配体浓度

仔细调整染料配体的浓度可以改变纯化因子,这种调整可用两个方法进行。一是在合成时引入染料浓度相同均一的。二是在一定浓度的染料-基质中加入未键合染料的基质,这时每一颗粒的染料浓度是不均匀的。例如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在染料柱上明显的不可逆吸附,可用降低配基浓度的方法来解吸。

3.pH

一般来说,蛋白质在低pH时与三嗪染料结合更为牢固,因此保留时需选用低pH,洗脱时则用高pH。

4.洗脱

磷酸盐、辅酶、核苷酸、底物、多元醇、表面活性剂及pH等洗脱剂都适用于染料亲和色谱。例如,纯化从羊肝等材料中提取的各种脱氢酶时,使用KCl或pH洗脱比核苷酸特异性洗脱能得到更为尖锐的峰,纯化后比活性更高。根据研究目的及蛋白质与染料的作用大小,可用脉冲、分段、梯度及停流洗脱。

王大虎 5.温度

从三嗪染料和Procion Red HE-3B柱上洗脱葡萄糖-6-磷酸脱氢酶时,随着温度的升高,洗脱所需盐的浓度增加。

6.操作步骤

①用5mL三嗪-琼脂糖填装层析柱,对大多数实际应用来讲,短而且粗的柱子能获得满意效果。长而细的柱子多用于纯化结合力弱的蛋白质,虽然流速会有所下降。

②用10倍柱床体积的层析缓冲液(20mmol/L,pH8.0 Tris-HCl,0.1mol/L NaCl)平衡装好的柱子。

③为了达到上样要求,蛋白质样品需转换成近似层析缓冲液的条件,即通过用层析缓冲液透析或1∶1稀释来进行。上样前样品液应经离心达到澄清。5mL柱子能上样50~200mg蛋白质样品。除非蛋白质结合容量特别高,通常上样蛋白质应在10~20mg/mL。

④上样到层析柱,缓冲液洗至A280值回到基线。

⑤5倍柱床体积洗脱缓冲液(20mmol/L,pH8.0 Tris-HCl,0.1mol/L NaCl)洗脱目的蛋白。

⑥检测洗脱组分中的目的蛋白,并汇集含活性蛋白质的组分。

⑦再生层析柱。先用3倍柱床体积1mol/L NaOH洗柱,再用10倍体积含0.02%、叠氮化钠的层析缓冲液洗柱。

(四)应用实例

实例1:新型染料配基对碱性磷酸酶的亲和纯化

X云等设计合成了一种含有碱性磷酸酶抑制剂——对氨基苯磷酸的新型偶氮染料配基,并将其偶联到凝胶Sepharose CL-6B上,制备出新型的亲和层析介质,用来分离纯化小牛肠中的碱性磷酸酶。图6-29所示为对氨基苯磷酸的合成路线,染料配基的结构如图6-30所示。

 

图6-29 对氨基苯磷酸的合成路线

(资料来源:X云,2001)

 

图6-30 染料配基的结构

配基与基质偶联的方法为:将0.1g染料配基溶于23.6mL纯水中,与10g洗涤滤干的交联琼脂糖Sepharose CL-6B一起,置于恒温水浴摇床,在3min内升到所需温度,然后加入NaCl作助染剂(终浓度为50g/L),30min后加入Na2CO3(终浓度为15g/L)固定。15min后再加入催化剂(DABCO),pH控制在9~10。偶联后的凝胶反复用纯水洗净。

将新的层析凝胶装入柱内,并用平衡缓冲液0.01mol/L Tris-HCl(pH8.0)、含0.001mol/L MgCl2、1×10-5mol/L ZnCl2平衡。取2mL粗酶制剂上样,缓冲液淋洗至基线,用洗脱液洗脱,当用0~1mol/L NaCl进行梯度洗脱时,所得色谱图见图6-31(1),若先用0.1mol/L NaCl洗去大量杂蛋白,然后再用0.03mol/L Na2HPO4洗脱所得色谱图见图6-31(2),1.0mL收集一管测酶活力,将洗脱酶峰汇集浓缩,测蛋白质含量。实验后层析柱用1.5mol/L KSCN再生。

 

图6-31 纯化碱性磷酸酶粗酶色谱图

酶活力 蛋白质含量

(资料来源:X云,2001)

结果表明:0~1mol/L NaCl进行梯度洗脱时,纯化倍数为13.6倍,活性回收率为69.5%,NaCl和Na2HPO4先X行洗脱,比活提高了65倍,活性回收率为89%。

实例2:采用染料亲和层析的方法纯化XX素

刘志勇采用自制的染料亲和层析从X期妇女尿X(HMG)粗品中分离纯化获得XX素(FSH)。

层析步骤为:

(1)上样及洗涤 染料亲和层析柱先用20mmol/L的硼砂(pH8.0)缓冲液平衡,然后上样,上样溶液的蛋白质浓度约为10mg/mL。用20mmol/L的硼砂(pH8.0)缓冲液循环2~4倍柱床体积。先用50mmol/L甘氨酸-NaOH缓冲液(pH10)洗涤5倍柱床体积,然后用50mmol/L甘氨酸-NaOH和0.2mol/L的KCl(pH9)缓冲液洗涤4倍柱床体积。

(2)洗脱 采用50mmol/L甘氨酸-NaOH缓冲液和0.2~3mol/L的KCl(pH9)溶液进行梯度洗脱。

用紫外检测仪监测蛋白质的洗脱峰,同时取样检测FSH的活性。对FSH组分进行超滤除盐,并用pH7.3的PBS调整其pH,结果如图6-32所示。

 

图6-32 染料亲和层析对FSH的纯化效果

(资料来源:刘志勇,2004)

从实验结果可知,染料亲和层析一步就可以把HMG中的FSH活性平均从1IU左右提高到190IU左右,纯化了近190倍,说明染料亲和层析的方法可以有效地分离纯化FSH,并且处理的量可以很大,活性回收率也很高。

 

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