王大虎

王大虎:凝集素亲和色谱

王大虎(一)基本原理

凝集素是一类能选择性结合碳水化合物的蛋白质或糖蛋白,将其作为亲和层析的配体可专门用于分离、提纯含碳水化合物的生物大分子,如糖蛋白等。其原理示意图见图6-33。也可用特异结合的糖作为配体,分离纯化凝集素。

 

图6-33 凝集素亲和层析原理示意图

(资料来源:汪家政,2000)

不同来源的凝集素其特异性有所不同,但具有共同的结构性质。它们都由一种或多种亚基组成,一般为四亚基蛋白质,每个亚基都有糖基结合位点。如果所有的亚基都相同,凝集素的多个结合位点都识别同一种特异性的糖基。如果它具有两种功能上有差别的亚基,凝集素就具有结合两种不同糖基的能力。比较常用的凝集素的一些重要的结构和性质列于表6-10中。

表6-10 凝集素亲和色谱中常用的凝集素

 

王大虎(二)凝集素色谱制备

1.凝集素的选择

由于不同的凝集素对不同的糖基有特异性(表6-10),因此针对某一特定的目标糖蛋白,应选择合适的凝集素。例如,许多受体结合于麦芽凝集素,而细胞因子和其他生长因子则优先结合于伴刀豆球蛋白A或者扁豆凝集素。选择凝集素时要考虑两个因素:糖蛋白上寡糖的性质和凝集素的可获得性。

糖蛋白上的寡糖可分为几种类型,每种类型都有其特点,这些特点影响着它们与凝集素的结合,从而可作为选择的一个重要参数。在不清楚待纯化糖蛋白的结构和性质时,应从一系列凝集素中筛选合适的类型。

目前有许多凝集素可以直接购得,甚至可以直接X已经偶联好的凝集素亲和吸附剂。如果没有商品化凝集素亲和吸附剂供应,可以自行将纯的目的凝集素固定到合适的活化载体上。

2.凝集素与载体的偶联

凝集素可以偶联到不同的活化载体上,常见的有以下几种类型:①固定到CNBr活化的Sepharose-4B上;②固定到Affigel-10或Affigel-15上;③固定到CDI-活化的琼脂糖上。Affigel-10和Affigel-15是交联琼脂糖的N-羟基琥珀酰亚胺酯,分别带10个或15个原子长的连接臂,蛋白质通过其X氨基与它们进行偶联。

在将凝集素偶联到活化载体上时,对于不同的凝集素,应在偶联缓冲液中加入相应的特异糖类和所需的二价离子。因为糖可以保护凝集素上的糖蛋白结合位点,防止这些位点被载体上的活化基团所交联,从而最大限度地保留糖蛋白的结合位点。对于需要二价金属离子的凝集素,二价金属离子能引起凝集素三维结构的转化,从而导致糖结合位点的形成,因此在偶联之前应加入所需的二价离子。偶联时凝集素的浓度应低于10mg/mL,因为当载体上固定过多的凝集素后,会产生空间位阻效应,干扰糖蛋白的结合。

将凝集素偶联到Affigel载体上的过程:

①清洗Affigel:将Affigel置于漏斗内,抽滤除去异丙醇,并用含100μmol/L所需二价金属离子和5%(50g/L)特异糖的pH8.4,0.1mol/L NaHCO3(偶联缓冲液)溶液清洗,注意勿使载体干燥。

②配制凝集素溶液:用偶联缓冲液配制5~7mg/mL的凝集素溶液。

③偶联:在每克清洗过的湿Affigel中加入1mL凝集素溶液,于4℃轻微混合过夜。

④封阻:加入1mol/L甘氨酸、甘氨酸乙酯或0.1mol/L乙醇胺,室温下放置2h。

⑤储存:用偶联缓冲液清洗凝集素-Affigel,将其储存于含有0.05%叠氮化钠的PBS(pH7.2)中。

将凝集素偶联到CDI-活化的琼脂糖上的过程如下:

王大虎
王大虎

①清洗CDI-活化的琼脂糖载体:将CDI-活化的琼脂糖置于漏斗内,抽滤除去丙酮,并用冰蒸馏水彻底清洗,切勿使凝胶块干燥。

②配制凝集素溶液:用含0.5mol/L特异糖的pH9.5、0.1mol/L NaHCO3溶液(偶联缓冲液)配制20mg/mL凝集素溶液。

③偶联:将1体积湿凝胶加到1体积凝集素溶液中,4℃轻微混合48h。

④封阻:用pH9.5、0.1mol/L Tris清洗,以封阻活化载体上未反应的位点。

⑤储存:依次用3体积pH4.0、0.1mol/L醋酸钠缓冲液,3体积pH8.0、0.1mol/L NaHCO3缓冲液洗两次,再用含0.02%叠氮化钠的PBS清洗并储存于其中。

王大虎 (三)基本操作

1.亲和柱的平衡

制备好固定化凝集素后,就可以将其装柱,然后用5倍体积的平衡缓冲液(如含0.1mol/L NaCl和1mmol/L所需二价金属离子的pH7.2,20mmol/L PBS)清洗、平衡。亲和柱的大小决定于样品量及凝集素对糖蛋白的吸附容量。为了提高凝集素结合效率,可以在平衡缓冲液中加入0.1mmol/L二价金属离子,为了改善样品稳定性可加入0.5%的洗涤剂。

2.样品的准备

用凝集素亲和色谱分离的糖蛋白分为两类:水溶性糖蛋白和膜结合糖蛋白。前者包括细胞分泌蛋白和结构蛋白,如激素、胶原蛋白等;后者有转运蛋白和细胞表面识别标记蛋白,如受体等。

在制备水溶性糖蛋白样品时,应将样品溶解于pH接近生理状态的磷酸或Tris-HCl缓冲液中,缓冲液可以采用比较高的离子强度。样品缓冲液中应含有1mmol/L所需的二价金属离子氯化物,且不能含有游离糖,以防止它们与糖蛋白竞争结合凝集素。样品缓冲液中应加适量抑菌剂,如0.05%叠氮化钠,以防止微生物污染。

在制备膜结合糖蛋白样品时,除了上面对水溶性糖蛋白的要求外,还必须设法将糖蛋白从细胞或膜上溶解下来,这时就需要在样品缓冲液中加入一些试剂,以破坏膜上的蛋白质-酯、蛋白质-蛋白质间的相互作用。这些试剂包括:强变性剂(如尿素、盐酸胍)、破膜试剂(如硫氰酸盐、碘化物)、有机溶剂(如乙醇、异丙醇)和洗涤剂。前三组试剂会导致蛋白质变性,因此多使用洗涤剂,但是对不同的膜结合糖蛋白,对其有效的洗涤剂也不同,且洗涤剂有可能影响糖蛋白与凝集素的结合效率,因此洗涤剂的浓度最好低于1%。一般来说,非离子洗涤剂如曲拉通X-100的效果比较好。

在洗涤剂破坏细胞后,溶酶体蛋白酶会释放出来,因此最好加入蛋白酶抑制剂,常用的有DTT(抑制巯基蛋白酶)、EDTA或EGTA(抑制金属蛋白酶)、PMSF(抑制丝氨酸蛋白酶)和抑胃酶肽(抑制酸性蛋白酶)等。

王大虎 3.加样及吸附

样品按照上述方式制备好之后,离心除去沉淀就可以直接上样,若要更好地将目标糖蛋白吸附在凝集素柱上,可降低上样时的流速。然后用平衡缓冲液洗2~5倍柱床体积,以除去非结合蛋白质。

4.洗脱

在洗脱结合的目标糖蛋白时,通常在平衡缓冲液中加入对凝集素有亲和性的糖或其类似物(见表6-10),以将目标糖蛋白置换下来,洗脱糖类的浓度一般为0~0.5mol/L。

由于疏水相互作用在糖蛋白与凝集素柱的结合中起重要作用,为了有效地洗脱,需要时可在加了特异性糖的缓冲液中再加入50%的1,2-乙二醇,以减少疏水作用。由于硼酸根离子能与一些多糖形成复合物,因此也可以尝试采用硼酸缓冲液洗脱糖蛋白。有时改变pH至酸性(但不低于3.0)或碱性(但不高于10.0),也能有效地将糖蛋白从固定化凝集素上洗脱下来,但必须保证目标糖蛋白的稳定性。将结合了糖蛋白的亲和柱于洗脱缓冲液中放置过夜,延长其解离时间,也可以提高产量。

总之,对不同的凝集素和目标糖蛋白,应采用不同的洗脱缓冲液,甚至将几种洗脱液组合起来,进行分段洗脱或者梯度洗脱。

5.固定化凝集素的再生和储存

色谱洗脱后,先用含1mol/L NaCl的平衡缓冲液洗色谱柱,再用含抑菌剂(如0.5g/L叠氮化钠)的平衡缓冲液再生亲和柱,然后就可将固定化凝集素在4℃储存于此缓冲液中。

(四)应用实例

实例1:泽泻凝集素(APL)的甲壳素亲和色谱

将片状甲壳素在酸溶液中加热,使其部分水解,装入1.5cm(内径)×20cm(长度)的亲和层析柱。将APL的粗提液先进行DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析,收集有凝血活性的洗脱峰,用S-20000 PEG浓缩至一定浓度,上甲壳素亲和层析柱。先用含0.5mol/L NaCl的pH7.0的0.02mol/L PBS冲洗,使不能结合的杂蛋白或其他杂质全部被洗脱下来。然后以45mL/h的速度洗脱。先用0.1mol/L的Tris-HCl(pH7.8,含3mol/L脲)洗脱,得到峰2。再用0.5mol/L甲酸(含3mol/L脲)洗脱,收集蛋白峰3,检测结果证明峰3具有凝集活性。APL的甲壳素亲和色谱图见图6-34所示。

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