王大虎

王大虎:免疫亲和色谱

王大虎  (一)基本原理

免疫亲和色谱(immuno-affinity chromatography,IAC)是亲和色谱中的一种特殊形式,它的原理是根据抗原与抗体之间具有高的特异性的亲和力,因此用适当的方法将抗原或抗体结合到色谱柱上,利用抗体或抗体片段作为固定的配体来保留其亲和力,便可有效地分离和纯化各自互补的免疫物质。

(二)免疫亲和色谱吸附剂的制备

1.免疫亲和载体的选择

通常用糖类介质(如琼脂糖、纤维素等)或合成的有机支持物(如丙烯酰胺聚合物、共聚物及其衍生物,聚甲基丙烯酸衍生物和聚醚砜)作为免疫亲和载体的介质,也有许多市售的此类介质,例如:(Schleicher & Schuell公司的商品)Affinica Agarose和Polymetric Supports,Pharmacia公司的商品Sepharosel Superose和Sephacry等,其中交联琼脂糖凝胶具备理想载体的多数特点,因此最为常用。

表6-11列出了主要的免疫亲和载体。免疫亲和载体的作用位点,主要是针对氨基酸侧链的残基(胺基、巯基、羧基)、末端的胺基和羧基以及寡糖链的糖基等。此外,基质也可以对蛋白质进行修饰,例如免疫球蛋白的生物酰化。

表6-11 主要免疫亲和载体功能基团

 

续表

 

王大虎 2.载体与配体的偶联

固定于载体上并具有免疫吸附活性的物质称为配体,两者间通过交联或偶联的方式相互作用。偶联过程包括预活化载体平衡和载体与抗体偶联。目前常用的活化载体法是CNBr活化法(图6-37)或N-羟基琥珀酰亚胺(NH)活化法(图6-38)。封阻未反应的活化基团主要是除去剩余的氰活化基团,常用试剂如乙醇胺、甘氨酸、1-氨基-丙二醇,最常用的是乙醇胺。抗体制备好后可以保存在含0.1%叠氮化钠的PBS中。

 

图6-37 CNBr活化固定法

 

图6-38 NHS活化固定法

免疫球蛋白抗体与活化好的载体偶联主要是通过重链、轻链上的氨基基团,其多点接触会引起其与抗原结合的位阻,因为抗原与抗体结合也需要氨基基团。在高水平的活化下,抗体本身也会阻碍结合。许多方法也被设计出来克服这个问题,如通过利用直接位点固定化,大多是依据免疫球蛋白在Fc片段的固定原理,能更有效地使用配体。

CNBr活化琼脂糖凝胶是把琼脂糖凝胶的羟基基团转换成氰酸盐酯基团,这些活化的载体具有与免疫球蛋白的赖氨酸基团和其他蛋白结合的能力。

NHS可以替代CNBr借助抗体或其他蛋白质的主要氨基基团对他们进行固定化。NHS形成的键在免疫吸附剂正常的操作和储存条件下极其稳定。随着对主要氨基基团的高度选择性,偶联反应也相对快速有效,同时巯基也参加反应。

3.抗体柱的制备

制备抗体柱的第一种方法是抗体首先结合到介质上。通常的共价法固定随机地结合抗体的3个片段,即Fc、Fab21、Fab22,被固定化后的抗体只有一部分保持与抗原结合的活力,且抗体中的Fc片段为结合位点,而不属于识别位点。

第二种方法的前提是所固定的抗体具有两个空间上分离的活性部位,以便该抗体能同时与两种抗原结合。首先,将抗原固定到介质上,然后结合上相应的抗体,由于二价抗体分子的一个活性部位是X的,这种介质-抗原-抗体复合物就可以用来纯化抗原。这种夹心式层析剂的最大优点在于不必进行抗体的纯化与固定化。

第三种方法是将抗体结合到已被固定的蛋白A或蛋白G小珠上,由于蛋白A或蛋白G结合在抗体的Fc区,所以结合抗原的部位获得充分暴露,从而易于接近,由于空间上分离的两个不同活性部位的存在,抗体能同时与两种抗原结合。该法的缺点是在洗脱抗原的过程中这种蛋白-抗体的复合物有可能会解离。

王大虎 (三)基本操作

1.样品的制备

样品经常是粗提取液含有细胞碎片和其他不溶的物质,这就需要对样品进行一些预处理,来防止色谱柱污染和不希望的非特异性的吸附。适当的方法有离心和用0.4µm的纤维素过滤。

2.吸附和流速

王大虎
王大虎

成功免疫纯化的关键步骤就是缓冲液的选用,来洗脱结合的目的蛋白,同样重要的是快速洗脱结合目的蛋白的条件。缓冲液的选择主要是依据要处理的样品,通常使用的偶联缓冲液pH=7~8(如磷酸盐或硼酸盐)并且含有0.1~0.5mol/L NaCl或微量的表面活性剂来减少非特异性黏合。洗脱的实际条件要依据亲和常数Ka和杂质的性质,如高浓度NaCl通过促进疏水作用引起杂质的黏合。

样品通过一定方式装柱到载体上,可能受到载体的机械限制以及载体孔隙中物质扩散速度的影响。为达到最佳的流速,流速应尽可能低,避免抗原吸附不充分被洗出,必要时可用循环。对于常压色谱柱,流速在30~50cm/h,而高效液相色谱流速在300~500cm/h。

3.前洗脱

色谱柱要用偶联缓冲液冲洗,去除任何未吸附的物质,非特异性结合的量由初始的偶联条件决定。用含有0.1~0.5mol/L NaCl初始缓冲液将实现相关的低杂质吸附和减少冲洗要求。如果杂质疏水作用减弱,弱离子冲洗就有效。延长冲洗可去除一些非特异结合的物质,但在得率与纯化率之间要获得平衡。通常,连续冲洗要直到获得稳定的紫外基线,即280nm吸收值为零。

4.洗脱

有效的洗脱要求一般是破坏抗体与抗原之间的结合键,如离子键、氢键和范德华力。洗脱条件要促进结合物质的解离,并保持目标蛋白质和固定配体功能和结构的完整。常用解离目的蛋白的方法是改变流动相,可以通过pH、离子强度、温度、表面张力和介电常数的改变,快速洗脱。为保留抗原与免疫吸附剂的活力,先用温和洗脱条件,再用极端pH、螯合剂、蛋白质变性剂和有机溶剂。为减少纯化抗原损害,可以将洗脱液收集到含中和缓冲液的收集管中或立即进行凝胶过滤。

王大虎(四)应用实例

杨勇等利用免疫亲和层析纯化大肠癌相关抗原:将透析浓缩后的细胞裂解液于4℃下反复上样过夜,以PBS洗柱至A280到基线,再以甘氨酸-HCl洗脱,得到1个高尖而小的洗脱峰,如图6-39所示。

 

图6-39 mAb CYL22亲和色谱纯化Hce28693细胞上的相关抗原

(资料来源:杨勇,2004)

Western-blot分析结果如图6-40所示,在还原条件下,可见Mr约为60×103和70×103的两条带,在非还原条件下可见Mr为130×103的条带,说明本实验所纯化的抗原为一种异源二聚体蛋白。该抗原亚基间的二硫键解离,出现更小的亚基。因此,该抗原可能是由Mr分别为60×103和70×103两个亚基组成的异源二聚体。

 

图6-40 纯化样品的Western-blot分析

(资料来源:杨勇,2004)

 

发表评论

电子邮件地址不会被公开。 必填项已用*标注