大虎说事

王大虎:固相金属离子亲和色谱

王大虎  (一)基本原理

固相金属离子亲和色谱(Immobilized Metal Affinity Chromatography,IMAC)也称金属螯合层析,是亲和层析的一种。金属离子与间隔介质相互作用进行固定,利用暴露的蛋白质残基和介质上的金属离子之间的相互作用进行纯化,这些金属离子能选择性和某些氨基酸与蛋白质表面的基团进行反应,从而在亲和柱中将蛋白质和生物大分子阻滞。

王大虎 (二)固相金属离子亲和吸附剂的制备

固相金属离子亲和色谱技术可以看作是高度特殊、高度亲和的生物亲和分离方法与较宽范围、低特异性的吸收方法的媒介。所以,在固相金属离子亲和吸附剂的制备过程中,为了能和蛋白质相互作用,固相化的金属离子必须是易于接近的,因此必须暴露出足够量的金属离子。在介质中接入一段的间隔介质,使其末端与金属离子形成复合物。表6-12为目前市场上比较典型的用于金属螯合的介质。

表6-12 典型固相螯合基团和金属离子

固相金属离子亲和色谱的多功能性是其一个重要的特点。在固相金属离子亲和色谱文献上对于特殊蛋白质与缩氨酸的性质不是很清楚的情况下,可以使用一种普遍的固定相(固定的双乙酸盐的亚氨基)和选择相对较强的亲和性的转移金属离子Cu2+。如果和样品的亲和性太强,可以尝试其他一系列的金属离子,如Ni2+或Zn2+,还可以试试对蛋白质有较低亲和力的固定金属螯合基团。

固相金属离子亲和色谱常规开放柱状的固定相是琼脂糖,其中一个例子就是用螯合的琼脂糖凝胶柱,它使用了亚氨基二乙酸(IDA)作为螯合配基,通过用金属离子和柱装载程序(用琼脂糖作为IDA的螯合凝胶)来装载固相金属亲和凝胶。

王大虎
王大虎

①将IDA的凝胶泥浆置于玻璃瓶中。灌注足够的比例进入烧结的玻璃漏斗中。用10倍柱床体积的水去除酒精防腐剂。

②在水中加入2~3倍柱床体积50nmol/L的金属离子溶质,混匀。

③用3倍柱床体积的水去除多余的金属离子。

④用5倍柱床体积的缓冲液对胶进行平衡。

⑤将悬浮的凝胶转移进入抽气的烧瓶。

⑥待柱的出口关闭后,将凝胶浆加入柱中,让胶沉淀几分钟;然后,打开出口。

⑦压紧一定体积的凝胶,在柱中嵌入适配器。

王大虎 (三)基本操作

1.样品洗脱

(1)pH梯度洗脱

对于不连续的缓冲液系统:

①在样品吸附后,用5倍柱床体积的缓冲液1(20mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4,pH7.0)洗脱。

②换成缓冲液2(20mmol/L NaAc-HAc,pH5.8)5倍柱床体积洗脱。

③用缓冲液2到缓冲液3(20mmol/L NaAc-HAc,pH3.8)的线性梯度洗脱。总体积为10~20倍柱床体积的量。

④最后,用附加的缓冲液3洗脱,直到洗脱的pH稳定和所有的蛋白质都被洗出。

对于连续的缓冲液系统:

①在样品吸附后,用2.5倍体积的缓冲液1洗脱。

②开始缓冲液1(pH7.0)到缓冲液4(20mmol/L NaAc-HAc,pH4.0)的线性梯度,总体积大约为15倍柱床体积的量。

③用附加的缓冲液4洗脱,直到洗脱的pH稳定。

④如果总数量所加的蛋白质没有完全被洗出,洗脱用小剂量的缓冲液4调节pH至3.5。

(2)咪唑梯度洗脱

①首先用5倍柱床体积的缓冲液5(20nmol/L咪唑)平衡。随后,用5~10倍柱床体积的缓冲液6(2nmol/L咪唑)平衡。

②在样品吸附后,用2.5倍柱床体积的缓冲液6洗脱。

③用缓冲液5到缓冲液6的线性梯度洗脱,总体积大约为15倍柱床体积的量。

2.操作注意事项

①为了便于一些蛋白质的洗脱,流动相可以添加修饰成分,如尿素、乙烯乙二醇、去垢剂和乙醇,也可以加入柱平衡和洗涤的缓冲液。

②为了保证高性能的色谱柱在使用几次后能再生,无需整根柱子再生,可以在缓冲液中加入一些低浓度的X金属离子,以便维持固定相所需的足够的金属离子。这不会影响蛋白质的重新溶解和洗脱顺序。

③最理想的不连续的缓冲液的pH梯度范围为6.0~3.5。醋酸盐比磷酸盐具有更强的洗脱能力。

④PBS的pH梯度范围为7.0~4.5较好。它有UV穿透的优势,比较适合缩氨酸的分析。

⑤对于不连续的pH梯度和咪唑梯度洗脱的方法,非离子两性缓冲液4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)可以用来取代磷酸盐。与PBS相比,HEPES是一个使金属离子洗脱比较弱的缓冲液,HEPES能较好地保持一些转运蛋白质(铁传递蛋白)与金属的结合能力。

⑥对于有特殊性质的蛋白质,逐步的pH梯度和咪唑梯度都可以用来取代所需的梯度形成装置。

⑦对于用咪唑亲和洗脱的方法,如果想要可再生的结果,实际上我们必须监控咪唑梯度的形成,可以通过诸如在230nm的吸光度或进行化学实验来实现。即使当层析柱事先用浓缩的咪唑饱和,然后用含有实际数量为2mmol/L的咪唑的缓冲液平衡。当亲和洗脱梯度引入时,固定的金属离子仍可以结合另外的咪唑。当使用简单的(不可设计的)梯度形成装置(典型的开放柱色谱),线性的咪唑梯度将不能形成,在开始的梯度下有小的咪唑洗脱峰将会导致一些蛋白质过早地被洗出。对于多级梯度,可以通过设计HPLC系统来克服这个问题。

(四)应用实例

张怀将金属螯合亲和色谱应用重组Hepcidin融合蛋白的纯化,在大肠杆菌中表达的重组Hepcidin融合蛋白以包涵体形式存在,其N末端带有6个组氨酸。以Ni2+-IDA-Sepharose Fast Flow为层析介质,在变性条件下以不同浓度的咪唑对Hepcidin融合蛋白的纯化效果进行了比较,确定了该融合蛋白的金属螯合亲和色谱纯化条件。以60mmol/L咪唑洗脱杂蛋白,及300mmol/L咪唑分段洗脱杂蛋白和Hepcidin融合蛋白,如图6-41所示。

图6-41 融合蛋白的咪唑分段洗脱曲线

(资料来源:张怀,2005)

因为降低pH可以减弱组氨酸和镍离子之间的作用力,所以以pH8.03.5的洗脱液进行梯度洗脱,结果表明融合蛋白在pH4.7~4.1洗脱出来,如图6-42所示。

图6-42 融合蛋白的pH梯度洗脱曲线

(资料来源:张怀,2005)

综合以上实验结果,此融合蛋白的纯化采用两步洗脱:①60mmol/L低浓度咪唑洗脱杂蛋白;②pH4.0洗脱融合蛋白。经两步洗脱纯化后的融合蛋白纯度大于95%,而且洗脱液中不含咪唑,高纯度重组Hepcidin融合蛋白获得为Hepcidin的制备奠定了基础。

 

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