大虎说事

王大虎:嗜硫亲和色谱

(一)基本原理

嗜硫亲和色谱(Thiophilic Adsorption Chromatography,TAC)又称嗜硫色谱、亲硫色谱。嗜硫色谱介质上配基的砜-硫醚基团在一定浓度的盐存在下,可与抗体(免疫球蛋白)表面适当的位点相互作用,对抗体和α2-巨球蛋白具有显著的亲和吸附特性。嗜硫作用使亲硫蛋白质在高盐环境中被嗜硫色谱柱吸附,随后在降低盐浓度的条件下进行洗脱。其中X盐和磷酸盐是最为常用的盐类。TAC的盐促吸附特性与疏水作用色谱(HIC)相类似,两者有着相似的吸附-洗脱X,但是它们在本质上是两种不同的分离纯化蛋白质的方法。这些不同点体现在以下几个方面:首先,TAC与(HIC)分别吸附不同种类的蛋白质。TAC主要对血清中的抗体有特异性吸附;而(HIC)则主要吸附血清白蛋白。这主要是两者不同的配基结构造成的差异,TAC的配基是亲水性的,无疏水性和离子力作用;而(HIC)配基主要是疏水性的脂肪族链或芳香环结构,利用其与蛋白质分子上的疏水残基(疏水补丁区域)的相互作用吸附“疏水性”蛋白质(hydrophobic proteins)。其次,盐对两者的效应不同。两者都是盐促吸附,但是对HIC吸附蛋白质有促进作用的NaCl反而减弱TAC的吸附效果,因此可用NaCl的缓冲液洗脱吸附于TAC柱上的蛋白质。再者,温度对两者的影响不同。TAC的吸附作用受温度影响小;而HIC则受温度条件控制,随着温度升高其疏水作用增强,反之降低。

王大虎 (二)TAC吸附介质

TAC填料一般以琼脂糖凝胶颗粒(如Sepharose CL-4B)为固相载体,在载体的羟基上偶联不同的含硫配基。合适配基的选择是采用TAC进行分离纯化的关键影响因素。常见的配基主要有线性配基、芳香环配基和杂环配基等三种结构类型。

1.线性配基结构

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发展最早的嗜硫色谱吸附剂称为T-gel,是琼脂糖经过二乙烯砜(DVS)活化,再与β-巯基乙醇作用生成砜-硫醚基团,该基团对蛋白质表面的适当位点产生特异性吸附(如图6-43所示)。

图6-43 T-gel的制备

(资料来源:刘玄,2006)

制备T-gel的方法为:琼脂糖凝胶Sepharose CL-4B用DVS活化6h(pH12),再与0.1mol/L 2-ME反应1h(pH11),所得产物称为pT-gel。Scoble等对该方法进行了改进,在20℃、pH12的0.5mol/L Na2CO3缓冲液中琼脂糖凝胶Sepharose CL-4B与DVS活化反应6h,活化后的胶粒再在pH11的0.2mol/L Na2CO3缓冲液中与等体积的0.2mol/L 2-巯基乙醇反应1h,所得产物称sT-gel。比较sT-gel与pT-gel对鸡卵黄抗体(IgY)的纯化效果,结果表明两种胶均可纯化IgY,纯度均可达到98%以上,但sT-gel对IgY的回收率高于pT-gel。傅蓉等利用T-gel分离纯化了IgY,蛋白质回收率达91.26%,IgY的活性回收率大于70%,纯度可达电泳纯。

这种最早的T-gel配基含有2个S原子,但随后的研究发现,配基中含有S的数目越多,其对抗体的亲和作用和吸附容量就越高。主要是含有砜基和硫醚的直链线性分子结构,其中S原子的数目为3~6个不等;当S被O和N代替时,其虽仍具有吸附蛋白质的能力,但其亲和作用均明显下降。这种合成的线性配基对抗体及其抗体片段有较高的亲和作用,其对IgG的吸附容量为18~28g/L(以单位体积TAC填料计)。

王大虎 2.芳香环配基结构

芳香环化合物配基通过“手臂”结构键合在固相基质上,其合成方法一是将芳香环化合物(如氨基苯酸、甲氧苯酚等)键合于经DVS活化的固相载体上,二是将巯基-芳香环化合物连接到经环氧化物活化的凝胶基质上。表6-13列出了其代表性配基结构。与普通的T-gel相比较,这种吸附介质对抗体的吸附选择性较低。如经DVS活化的琼脂糖在4-氨基苯酸或4-甲氧苯酚作用下形成的配基,在0.175mol/L(NH4)2SO4的存在下除了吸附抗体外,对其他一些蛋白质也产生吸附作用。Porath等认为其对抗体的作用介于普通T-gel TAC与HIC之间。

表6-13 常见芳香环及杂环配基

王大虎 3.杂环配基结构

为获得对抗体具有高特异性、高吸附容量及稳定性更好的吸附剂,带有杂环配基的吸附剂相继被合成。主要包括:①通过硫醚键将杂环配基偶联在固相载体上,这种载体可从血浆中吸附抗体、α2-巨球蛋白等,而对血清白蛋白无吸附性。②应用一系列基于吡啶-烷基硫醚结构的配基,发现巯基-嘧啶比巯基-苯更能有效地选择性吸附抗体蛋白。③包括2-羟基吡啶、3-羟基吡啶、4-羟基吡啶和咪唑等的一些杂环配基,这些配基均显示出很好的吸附容量,其中羟基-吡啶被认为是一种比较理想的配基,可以将IgG与血清白蛋白更好地分离。④在经环氧化物活化的固相载体(硅胶或琼脂糖颗粒)上连接含有S原子和N原子的配基,S同时出现在“手臂”结构及杂环自身结构中。配基可在中性条件下吸附抗体,且吸附过程不依赖盐的存在,这类配基含有2个S[一个是由DVS活化反应所引入,另一个则来自杂环化合物(2-巯基吡啶、2-巯基嘧啶及2-巯基烟酸)]。表6-13列举了上述配基的几种典型结构。

(三)基本操作

(1)样品制备 制备时使样品处于高盐环境,其中X盐和磷酸盐是最为常用的盐类。

(2)装柱 凝胶在平衡的缓冲液下,浇注到色谱柱,胶面在重力下凝结,尽量减少胶面上的空间。

(3)洗脱 通过盐浓度的降低来洗脱,比如用蒸馏水和缓冲液。

(四)应用实例

实例1:应用嗜硫色谱分离纯化五步蛇蛇毒

在20℃,pH12的条件下,将DVS(80mg/g胶湿重)和琼脂糖凝胶Sepharose CL-6B置于等体积0.5mol/L Na2CO3缓冲液中活化6h。活化过的凝胶在pH11,0.2mol/L Na2CO3缓冲液中与等体积的0.2mol/L的β-巯基乙醇反应1h,以使其与巯基乙醇完全偶合。向滤液中加入Na2SO4,调节其浓度至0.5mol/L,T-gel柱(1.6cm×5.9cm)用含0.5mol/L Na2SO4的蒸馏水平衡上样,线性流速为0.8mL/min,检测波长为280nm,蒸馏水洗脱,然X行电泳分析,步骤略。

图6-44所示的Tc为穿透峰,Tx为蛇毒洗脱峰,分别对其进行SDS-PAGE得到图6-45,可见洗脱峰电泳后得到比较纯的一条带3,分子质量大概是44ku,说明蛇毒可以用TAC分离纯化得到一种比较纯的蛋白质,进一步研究得知该蛋白质具有抗凝血活性和蛋白酶活力。

 

图6-44 五步蛇蛇毒TAC图

Tx—蛇毒洗脱峰

Tc—穿透峰

(资料来源:潘建茹,2005)

图6-45 五步蛇蛇毒TAC各组分SDS-PAGE图

1—蛇毒原液 2—穿透峰(Tc) 3—洗脱峰(Tx) 4—蛋白质标样

(资料来源:潘建茹,2005)

实例2:应用嗜硫色谱对鸭蛋蛋黄抗体(IgY)进行嗜硫色谱分离纯化

具体操作同应用嗜硫色谱对五步蛇蛇毒进行分离纯化。

图6-46得到比较尖的洗脱峰,对其电泳得到图6-47,可知洗脱峰经电泳得到两条条带(T),分子质量分别为200ku和120ku,与被证明过的鸭蛋蛋黄中含有两种抗体相吻合。由TAC分离制备的鸭蛋抗体纯度为电泳纯,IgY回收率很高。

图6-46 鸭蛋蛋黄抗体的TAC图

(资料来源:潘建茹,2001)

图6-47 鸭蛋蛋黄抗体的SDS-PAGE图

(资料来源:潘建茹,2001)

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