王大虎

王大虎:疏水作用色谱

王大虎  一、基本原理

疏水作用色谱(Hydrophobic Interaction Chromatography,HIC)是基于溶质、极性流动相和非极性固定相表面间的疏水效应建立起来的层析技术,是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团,这些疏水性基团称为疏水补丁,疏水补丁可以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。疏水作用色谱就是利用这些疏水程度和性质的不同而进行蛋白质的分离的,其基本原理如图6-48所示。

图6-48 疏水作用层析的原理

P—固相支持物 L—疏水性配体 S—蛋白质或多肽等生物大分子 H—疏水补丁 W—溶液中水分子

溶液中高离子强度可以增强蛋白质和多肽等生物大分子与疏水性层析介质之间的疏水作用。利用这个性质,在高离子强度下将待分离的样品吸附在疏水性层析介质上,然后线性或阶段降低离子强度选择性地将样品解吸。疏水性弱的物质,在较高离子强度的溶液作用下被洗脱下来,当离子强度降低时,疏水性强的物质才随后被洗脱下来。

王大虎 二、基本操作

1.疏水介质的选择

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支持物(交联琼脂糖)、交联琼脂糖支持物与苯基共价结合的物质Phenyl-SepharoseTM6 Fast Flow是常用的一种疏水性层析介质。苯基作为疏水性配体,可以与疏水性物质发生疏水作用。Phenyl-SepharoseTM6 Fast Flow结构示意图如图6-49所示。

图6-49 Phenyl-SepharoseTM6 Fast Flow结构示意图

配体的选择主要通过经验和小规模示范性实验来确定。例如,膜蛋白的疏水性很强,可以不可逆转地连接到疏水配体上,导致样品的损失。较弱的疏水配体如X,在上述情况下是最好的选择。事实上,对于无标记的蛋白质,最好用疏水配体,特别是材料很少同时要求回收率高的样品。用于支持配体的基质需要两个特征。首先,它必须是惰性的,必须是不存在束缚蛋白表面的功能基团。其次,它必须有足够的机械强度来耐受压力。目前层析系统的制造商X的用合适基质包装的柱子,能适用于不同的疏水配体。

用于HIC介质的疏水配基很多,如羟丙基、丙基、苄基、异丙基、苯基、戊基、辛基等。通常,配基通过稳定的非离子键(如醚键)与基质结合。图6-50所示为几种常用的配基结构及其与配基的连接方式。迄今为止,广泛使用的商品化制备型HIC介质配基仍是烷基和芳基,常见的商品化制备型HIC介质见表6-14。

图6-50 几种常用配基的结构及其与基质的连接方式

表6-14 主要的商品化制备型HIC介质

注:①*为Toyopearl系列按粒径大小分为三个等级,C:60~150µm,M:40~90µm,S:20~50µm

②MA:甲基丙烯酸酯 A:琼脂糖 C:纤维素 PS:聚苯乙烯

早期的疏水层析介质是以CNBr活化偶联的方法制备的,此法制备的疏水介质因为引入了正电荷而同时具有离子交换性,所以在分离过程中会引起非特异性的吸附。目前用于制备用途的HIC介质的基质主要有多糖类(如琼脂糖、纤维素)和人工合成聚合物类(如聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯)。其中,半刚性的琼脂糖类凝胶仍是应用最广泛的疏水介质。超大孔琼脂糖作为HIC介质的基质,在扩散孔的基础上增加了对流孔,传质速率快,能在流速较高的情况下获得较好的分辨率。另外,由于壳聚糖具有良好的生物相容性和化学稳定性,近年来在HIC中也得到了应用。

王大虎 2.上样与洗脱

上样时,高离子强度可加强样品的疏水性。盐可增加水相的极性,提高界面的表面张力,同时可使蛋白质暴露出临近界面的非极性基团,容易形成疏水作用。所以盐浓度越高,促疏水作用越强。通常情况下会选择X铵,主要是因为其溶解性好,具有较高的溶解度,同时在280nm处有低的吸光度,价格便宜。这些性质决定了用X铵用于分盐析。但是,盐的种类的选择也不只简单是考虑溶解性好的问题。盐的浓度只要维持于能使其连接在疏水基质上的水平,这种经济的方法也就使得蛋白质只要经X铵沉淀后就能用于HIC纯化。但在高盐浓度下,疏水吸附作用会增大至大多数蛋白质都能吸附于基质上,HIC就难以得到很好的分辨率,表6-15列出了Hofmeister系列的离子供选择。

表6-15 Hofmeister离子系列

注:离子排列顺序为从上到下疏水性逐渐减弱。

洗脱时,跟IEC相反,HIC采用高盐吸附,低盐洗脱;洗脱样品又可直接或稍加稀释后加上其他层析柱,作为连接层析步骤的桥梁,取代盐析沉淀技术。HIC的洗脱无需有机溶剂洗脱,可以很好地保持生物活性。

三、应用

HIC是一种非常有效的分离纯化技术,它和其他分离手段组合在一起已成功地对多种蛋白质进行了分离纯化,表6-16所示为HIC用来纯化蛋白质的应用实例。

表6-16 疏水色谱用来纯化蛋白质的应用实例

实例1:鸡蛋溶菌酶和鲸肌球蛋白的同步分离纯化

采用Phenyl Sepharose HP色谱柱,实现对鸡蛋溶菌酶和鲸肌球蛋白混合样品的同步分离。操作过程:①用5倍柱体积的缓冲液A(50mmol/L磷酸钠,pH为7.0;2mol/LX铵)平衡柱子,保证稳定。②进样1.5mL样品,用4倍柱体积缓冲液A冲洗柱子,用0~100%的缓冲液B进行梯度洗脱,洗脱体积大于30倍柱体积,收集取样1mL。③用4倍柱体积的缓冲液B(pH7.0,50mmol/L磷酸钠缓冲液)进行洗脱。流速控制:2mL/min,测定在280nm吸光度值,所得色谱图见图6-51。

图6-51 鸡蛋溶菌酶和鲸肌球蛋白的HIC解析曲线

(资料来源:浦宇,2004)

从上图可见,鸡蛋溶菌酶和鲸的肌球蛋白经过HIC后达到基线分离。

实例2:纯化破伤风毒素

顾洁等在利用HIC纯化破伤风毒素时,破伤风毒素培养滤液经Phenyl Sepharose疏水层析除去大部分杂质蛋白质。在室温条件下,将毒素滤液与2mol/LX铵-磷酸盐溶液等量混合。通过Phenyl Sepharose疏水层析,分别用1mol/LX铵-磷酸盐溶液、0.5mol/LX铵-磷酸盐溶液、50µmol/L磷酸盐缓冲液洗脱,使毒素层析纯化。

结果见图6-52,得到三个峰。第一个峰为流穿峰,第二个峰为杂质,第三个峰为毒素。毒素纯度大幅提高,可将大部分杂蛋白除去,达到了较好的分离效果。

图6-52 破伤风毒素在Phenyl Sepharose柱上的洗脱图

(资料来源:顾洁,2006)

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