王大虎

王大虎:反相色谱

一、基本原理

反相色谱是以疏水作用为基础的色谱分离模式。与正相色谱相对应,反相色谱X中固定相的极性小于流动相的极性,而正相色谱固定相的极性大于流动相的极性,它们之间的比较见表6-17。在反相色谱中,极性大的组分先洗出,极性小的组分后洗出。由于不同的蛋白质具有不同的表面疏水结构,使得它们与固定相之间相互作用的疏水力存在大小不同的差异,通过改变流动相极性的大小从而将有效成分分离出来。

表6-17 正相色谱法与反相色谱法比较

反相色谱和HIC的不同在于,在反相色谱中所用的基质结合的配体密度大,疏水性强,对蛋白质类物质具有较大的疏水作用力,若要将吸附物解析下来,必须用含有较低极性的有机溶剂作为流动相。由于洗脱液的极性降低,常常会引起具有空间结构的大分子活性物质变性,因此反相色谱一般较适合分离纯化分子质量小的肽类和辅基等物质。HIC所用基质的性能与反相色谱不同,即HIC中的基质结合的配体密度小,疏水性弱,对蛋白质及其复合物仅产生的疏水作用力相对温和,吸附物更容易被解析下来。反相色谱与HIC的比较见表6-18。

表6-18 反相色谱与HIC的比较

反相高效液相色谱(RP-HPLC)是反相色谱的主要部分,在蛋白质和多肽的分离中被广泛应用,下文以其为例,对反相色谱进行详细介绍。

二、基本操作

(一)RP-HPLC柱的选择

将RP-HPLC柱用于多肽和蛋白质的分析分离时,为了得到满意的结果,首先应选择最优的色谱柱,主要是需要考虑色谱柱的一些变量,如载体、键合相、孔径、颗粒大小和色谱柱尺寸等。

1.填充载体

大多数用来分离多肽和蛋白质的商业化RP-HPLC柱都是硅胶基质的,用该法分离小分子化合物已经有一定的历史了。硅胶提供了很好的机械稳定性,并且由于它能与多种相键合的优点,它又提供了很宽的选择范围。硅胶基质可以分为薄壳型和全多孔微粒两类。目前,一种更纯、含极低金属成分的硅胶(纯度为99.99%)得到了发展,这种硅胶含有较低酸度的烷基硅醇。

目前使用RP-HPLC来分离多肽和蛋白质的多聚物基质的柱子得到了更广泛的应用。合成的多聚物基质柱,如交联的二乙烯基聚苯乙烯通常在pH为1.0~14.0的范围内仍很稳定,它们很容易在使用完后在强酸(1mol/L H2SO4)或强碱(1mol/L NaOH)溶液中清洗,这就使得它有了更宽的适用范围。尽管大多数的聚合物基质在机械强度、选择性和有效性方面仍劣于硅胶基质,但是一种更新的材料如PLRP-S(Polymer Laboratories,Church Stretton,Shropshire,UK)在混合物分离中显示出更好的工作性能。最近的研究表明,在高pH(>8.0)下聚合物基质的使用能够提供独一无二的选择性和用经典酸性流动相进行的补体分离。

王大虎  2.键合相

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在RP-HPLC中的固定相,往往是借助键合方式,将不同长度的碳链烷基化合物(如C2、C4、C6、C8、C16和C18等)、苯基或多芳香烃类化合物结合到全多孔微粒硅胶表面构成的,如图6-53所示。其中使用较多的是C18烷基键合硅胶(称ODS固定相)。烷基链长度对分离效果有影响。一般来说,烷基链越长(C2~C18)越能有效地与肽类或蛋白质结合。当烷基长链为C18,蛋白质的分子质量较大时,二者可能会结合得过紧,因而产生极困难的洗脱问题。若使用高浓度有机溶剂洗脱下来,会导致分离物生物活性的丧失。这时如将C18改为C4、 C8或苯基的硅胶衍生物进行,结果会好许多。所以,通常用C18分离小分子化合物会达到比较好的结果。

图6-53 键合相形成

键合硅胶中烷基链长度和键合量与固定相中样品容量、柱效和分离选择性也有关系。正常情况下,当键合相表面浓度相同(1µmol/m2)时,在烷基链长度增加的过程中,碳含量和溶质滞留值均会增加,固定相的稳定性将会得到提高。这是ODS固定相比其他烷基键合相应用普遍的主要原因。

3.颗粒大小

理论上,当颗粒尺寸减小时,色谱柱效将随颗粒尺寸的平方的减小而增加。然而,伴随着颗粒尺寸平方的减小,操作压力将随之增加。对于小分子来说,理论上描述为柱效能应该在减少微粒尺寸时得到提高。这通常是大多数商业上使用的RP-HPLC柱在用作蛋白质分离时出现的一种情况。颗粒尺寸为5~10µm的柱在效能上基本没有差别。现在所利用的颗粒孔径为2~3µm的柱能够给予更好的分辨率。另外,色谱柱的体积(长度缩短)及仪器谱带变宽的贡献减少,这些对洗脱峰的最终体积有很重要的影响。最佳的柱构型需要在柱效、压力差、峰体积和与现在所使用的仪器的相容性这些条件中进行权衡。对于现在的仪器来说,色谱柱长度约为100mm,颗粒孔径为3µm,这是最佳的条件。

4.孔径大小

反相色谱吸附剂一般是多孔颗粒,并且绝大多数活性表面都在孔内。因此,为了能被吸附和分离蛋白质,孔径大小要有一定的限制。一般来说,分离纯化小分子化合物(如数个氨基酸构成的肽),选用的基质孔径大小为7.5~12.0nm,分离较大分子的肽类化合物时采用的基质孔径为30.0nm。

王大虎 5.色谱柱尺寸

色谱柱的体积、长度和内径可直接影响分离效果及分离物的数量。但色谱柱体积大小又是根据分离物数量及其有效成分与杂质间理化性质差异性确定的。色谱柱一般长度5~70cm,内径1~50mm。用于分析型或微量制备柱的内径为2mm,甚至有时也用<1mm的微径柱。用于制备较大规模样品(毫克级)的柱内径为4~20mm,用于制备大规模样品(克级)的柱内径≥50mm。典型的色谱柱长度为15~30cm,有时为分离疏水性较强、数量较大的样品时,可选用长度缩小,内径加大的色谱柱进行;有时为分离吸附力弱、杂质多的样品,可选用长度加大,内径缩小的色谱柱进行。

(二)流动相

通常RP-HPLC所使用的流动相是由水、混合有机溶剂、溶解的缓冲液和盐的混合物组成的。由于含有易挥发的有机溶剂,导致组分很容易发生改变。洗脱中,溶剂选择的基本原理是“相似相溶”。分析物溶解度的控制是成功的关键。一般通用的流动相系统,常以1g/L三氟乙酸(TFA)为含水溶剂,以乙腈、醇类(甲醇、异丙醇等均可最大比例与水混合)为有机溶剂。

王大虎 1.有机相

现在使用最多的有机溶剂有乙腈(ACN)、甲醇、1-丙醇和2-丙醇。ACN是使用最广泛的有机溶剂,因为它易挥发,在收集的馏分中易分离出来,低的黏度保证了最小的柱反压力,在短波处几乎没有UV吸收,高纯度下很有效,并且在RP-HPLC分离中有较长的证明其可靠性的历史。丙醇比ACN黏度高,会带来较高的柱反压力,但是在使用低流速和短色谱柱时则没有显著差别。在使用含有丙醇的流动相时,回收率通常较高,尤其是对于结构复杂的蛋白质(如卵清蛋白)。所以,在ACN中加入1%~5%的2-丙醇,已经证明在某种程度上会提高蛋白质的回收率。甲醇或者其他溶剂相对于常被使用的溶剂来说几乎没有什么优势,并且一般情况下它不用作蛋白质的分离。

2.流动相添加剂

最常用的流动相少量成分为氟代链烷酸(如TFA和七氯氟乙酸)。这些物质使得蛋白质在有机溶剂中的溶解度增加。TFA是一种完全解离的酸,因为它是完全挥发性的,不腐蚀不锈钢,在短波长下几乎没有UV吸收光谱,并且在RP-HPLC多肽分离中有很长的历史证明其可靠性。通常以1g/L的TFA作为弱的疏水离子配对试剂。其他常用的添加剂有吡啶醋酸盐缓冲液和以正磷酸为基础的缓冲液,尤其是四乙铵高氯酸盐(TEAP)。离子配对试剂如庚烷、辛烷X、SDS或者烷基铵盐可能会被加入流动相中,来有选择性的增加带有大量相反标记的蛋白质的保留时间。其他添加剂可能会根据所分析的蛋白质的特性来添加。

王大虎 (三)梯度洗脱

洗脱液中有机相的浓度通常被用来获得较好的峰型和优化选择性。最初的有机相浓度范围是,从对于亲水性肽类的1%~5%到对于较大或疏水性蛋白质的10%~50%。然而,大多数的肽类是在有机相浓度为50%或更少的情况下洗脱的,较大分子质量或具有疏水性的蛋白质可能会要求95%的有机相来洗脱。梯度倾斜度(单位体积或时间下有机相改变的百分数)一般为(1%~2%)/min。然而,较浅的梯度[如(0.1%~0.5%)/min]常用来分离含有相似组分的复杂混合物。洗脱液分为A液(0.1%TFA,在1L的水中加入1mLTFA)和B液[ACN∶水(73∶30)+0.085%TFA]。

通常,提高RP-HPLC温度可以提高柱效,控制保留重现性或缩短运行时间。对于小分子质量样品,色谱柱温度的改变也能够影响分离选择性。在RP-HPLC中,保留时间会随着温度的升高而下降。

RP-HPLC的主要应用领域包括多肽和蛋白质的纯化制备和分析、蛋白质的肽图分析、酶活力分析、检测蛋白质构象改变、研究蛋白质折叠和稳定性中的疏水相互作用等方面。

(一)多肽及蛋白质的纯化制备和分析

对于分子结构比较简单的多肽和某些蛋白质,在不影响产物活性或产物在RP-HPLC后很容易重新折叠复性的前提下,用RP-HPLC进行纯化制备是一项高效的手段。同时,RP-HPLC具有分辨率高和重复性好的特点,使它在蛋白质及多肽分析领域占据核心地位。尽管在RP-HPLC中有机溶剂的存在及疏水固定相的影响可能导致蛋白质三维结构的改变,但这对分析鉴定并不重要,虽然被分析的蛋白质发生了变性,却能够给出该蛋白质的结构特征及疏水性等信息,并将其精确地与其他蛋白质相区分。

近年来,关于多肽及蛋白质的RP-HPLC纯化也取得了许多成功的实例,一些纯化实例如表6-19所示。

表6-19 RP-HPLC纯化多肽及蛋白质实例

实际上,RP-HPLC可用于绝大多数的多肽纯化。RP-HPLC流动相以水为基本组成部分,与肽的生物学性质相适应,虽然流动相中的酸、有机溶剂以及固定相均可能使肽的天然构象发生变化,但当这些因素除去后,肽的构象一般能恢复原状,因此RP-HPLC中,肽的回收率一般在80%以上。

与分子质量小、空间折叠相对简单的多肽相比,蛋白质的RP-HPLC分离经常存在一些问题,易造成谱带扩散、峰形拖尾等问题,甚至发生变性和不可逆吸附,引起回收率和分辨率的降低。因此,随着蛋白质体积和疏水性的增加,纯化难度也会增加。但是,选用适当的操作条件,也可用RP-HPLC对某些蛋白质进行纯化,其中就有用RP-HPLC对大豆蛋白进行了纯化和定量分析的报道。下面通过实例来介绍RP-HPLC纯化蛋白质的操作过程。

新鲜板蓝根初提液经阳离子交换色谱后得到SP-2峰,其中含有X蛋X,由于它们各自的分子质量相差较小,且带电性质相似(在离子色谱上同一盐浓度位置被洗脱),继续用凝胶过滤或离子交换对它们进行分离存在难度。因此,采用反相色谱柱对SP-2进行进一步的分离。

色谱条件为:Oligo-R3 C18色谱柱,流动相A液(0.1% TFA);B液(0.1% TFA+80% ACN);上样量5mL;以ACN体积分数为0~55%的梯度洗脱;流速1.0mL/min;检测波长280nm。SP-2峰经反相高效液相色谱的分离图谱如图6-54(1)所示。所得到的三个色谱峰经SDS电泳鉴定,已达到电泳纯,如图6-54(2)所示。

图6-54 待测蛋白混合物的RP-HPLC图及SDS电泳鉴定图

(1)RP-HPLC图(2)SDS电泳图

(资料来源:徐黄兆,2007)

(二)蛋白质的肽图分析

阐明蛋白质的结构、功能,对蛋白质进行深入研究都离不开对其一级结构、修饰位点等的了解。在蛋白水解酶(如胰蛋白酶)或化学试剂(如溴化氰)作用下,蛋白质可被部分裂解,RP-HPLC对肽段混合物可进行有效分离。在这一过程中所获得的反相色谱图即称为该蛋白质的“肽图”。肽图法已成为RP-HPLC在蛋白质及多肽分析中最重要、最广泛的应用,已用于重组蛋白质量控制、疾病诊断等诸多领域。

肽图中常采用C18柱,由于酶消化产物含有大量疏水性各不相同的肽段,因此多采用较窄的梯度并延长梯度时间。由于蛋白质酶解产物中肽段分子质量通常较小,借助反相肽图进行蛋白质及多肽分析可得到重复性好、分辨率高的结果,已有多种多肽及蛋白质用RP-HPLC进行了肽图分析,见表6-20。这其中既包括人生长激素、人粒细胞集落X因子这样的重要药物蛋白,也包括聚乙二醇-人生长激素这样的蛋白质修饰产物。肽图分析有利于确定产物的一级结构,并有可能确定修饰位点。

表6-20 肽图分析多肽及蛋白质实例

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