王大虎

王大虎:聚焦色谱-基本原理

聚焦色谱(chromatofocusing)是在IEF方法的基础上演化出来的一种柱色谱技术,该方法进行蛋白分离纯化的依据是不同蛋白质等电点的差异和离子交换行为的原理。由于具有聚焦作用的性能,使得其具有高分辨率和浓缩样品的优点,同时,在层析过程中pH梯度自动形成,操作简便,因此,可有效应用于蛋白质、多肽、核酸的分离纯化。

王大虎(一)多缓冲剂和多缓冲离子交换剂

聚焦色谱技术所采用的固定相属于离子交换剂,可看作是IEC。但它与IEC所不同的关键在于,其流动相是多缓冲剂,固定相是多缓冲离子交换剂。

1.多缓冲剂

多缓冲剂是由一系列多羧基多氨基化合物组成的两性电解质缓冲剂,其性质类似于两性载体电解质,它在较宽pH范围下具有相似的、较强的缓冲能力。Pharmacia公司设计的多缓冲剂产品有polybuffer96和polybuffer74两种,分别在pH6~9和pH4~7区段具有较强缓冲能力,它们在这两个pH范围内能提供一个平滑的线性梯度,滴定曲线见图6-55所示,将它们混合一起,缓冲能力的pH范围为4~7。此外,pH8.0~10.5的两性电解质也具有多缓冲剂的性能,可应用于pH9以上的聚焦色谱。

王大虎
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图6-55 多缓冲剂polybuffer96和polybuffer74滴定曲线

(资料来源:陈来同,2004)

多缓冲剂的紫外吸收在250nm处较高,而在280nm下较低(多缓冲剂紫外扫描结果见图6-56),所以聚焦色谱的洗脱检测波长应选在280nm处。

 

图6-56 多缓冲剂的紫外吸收光谱

(左:polybuffer96,右:polybuffer74)

(资料来源:陈来同,2004)

王大虎 2.多缓冲离子交换剂

Pharmacia公司生产的多缓冲离子交换剂也有两种:PEB94和PEB118,应用范围分别是pH4~9和pH8~11,即多缓冲剂polybuffer96和polybuffer74所匹配的多缓冲离子交换剂是PEB 94,pH8.0~10.5的两性电解质与PEB 118相配合使用。PEB 94和PEB 118是以Sepharose 6B为基质,把多种类型带电基团通过醚键与之偶联。由于多种电荷基团的存在,所以多缓冲离子交换剂缓冲能力很强,在pH3~12范围的水溶液、盐溶液和有机溶剂中都是稳定的,也能稳定于8mol/L的尿素中。多缓冲离子交换剂具有很好的物理稳定性,层析过程分辨率不会因为流速过快而受到影响。

多缓冲离子交换剂PEB94和PEB118之所以适合不同pH范围,是因为它们的操作容量与pH有着密切的关联。如表6-21所示,PEB 94在pH4~9每100mL操作容量是3.0~3.9mmol,而在这一范围之外,其操作容量显著降低,同样,PEB 118情况也是如此,它在pH8~11的操作容量也远大于其他情况。

表6-21 不同pH条件下多缓冲离子交换剂PEB94和PEB118的缓冲容量

 

(二)色谱原理

聚焦色谱原理包括pH梯度溶液的形成、蛋白质的行为和聚焦效应三方面。

1.pH梯度溶液的形成

在聚焦色谱中,当洗脱液流进多缓冲交换剂时,由于交换剂带具有缓冲能力的电荷基团,pH梯度溶液是自动形成的,不同于在IEC中,靠梯度混合仪实现pH梯度溶液。例如,当选用阴离子交换剂PBE94时,欲形成pH9~6的梯度,用起始缓冲液平衡至pH9,再用pH6的多缓冲剂物质作为洗脱液进行洗脱,随着多缓冲剂的注入,酸性最强的组分与碱性阴离子交换,对结合发生中和作用,柱内每点的pH从高到低逐渐下降。从色谱柱顶部到底部就形成了pH6~9的梯度。聚焦色谱柱中的pH梯度溶液是在洗脱过程中自动形成的,随着淋洗的进行,pH梯度会逐渐向下迁移,从底部流出液的pH却由9逐渐降至6,并最后恒定于此值。如图6-57所示。

 

图6-57 PBE94柱聚焦色谱的pH梯度形成示意图

(资料来源:X,2002)

王大虎 2.蛋白质的行为

蛋白质所带电荷取决于它的等电点和层析柱中的pH。当蛋白质所处环境的pH低于其等电点时,蛋白质带正电荷,因此不与阴离子交换剂结合。而随着洗脱剂向前移动;当蛋白质移动至环境pH高于其等电点时,蛋白质由带正电变为带负电荷,并与阴离子交换剂结合。由于洗脱剂的通过,固定相中的pH是随着洗脱时间延长而不断下移,蛋白质周围的环境pH再次低于等电点时,它又带正电荷,并从交换剂解吸下来。

随着洗脱液向柱底的迁移,上述过程将反复进行,于是各种蛋白质就在各自的等电点被洗下来,从而达到了分离的目的。不同蛋白质具有不同的等电点,它们在被离子交换剂结合以前,移动的距离是不同的,洗脱出来的先后次序按等电点排列,如图6-58所示。

 

图6-58 pH梯度溶液形成示意图

□代表等电点为7的蛋白质 ○代表等电点为8的蛋白质

(资料来源:X,2002)

王大虎   3.聚焦效应

不同蛋白质按各自等电点在pH梯度环境中进行排列的过程称作聚焦效应。pH梯度的形成是聚焦效应的先决条件。如果将一种蛋白质加到已形成pH梯度的色谱柱上时,由于洗脱液的连续流动,它将迅速地迁移到与它等电点相同的pH处。从此位置开始,其蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附,直到在等电点时被洗出。如果在此蛋白质样品被洗出前,再加入第二份同种蛋白质样品时,后者不被固定相吸附而是随洗脱液的同样的速度向前移动,直到其迁移至近似本身等电点的环境处,也即第一个样品的缓慢迁移处。接下来,两份样品吸附、解吸附,以同样的速度缓慢进行迁移,最后同时从柱底洗出。因此,在聚焦层析过程中,同种样品可分多次加入,但需保证第一次的样品仍未洗脱出来,如图6-59所示。

 

图6-59 层析聚焦效应示意图

(资料来源:X,2002)

 

 

二、基本操作

 

(一)多缓冲剂的选择

多缓冲剂的选择是依据聚焦层析的pH梯度范围而定的,而pH梯度范围是受被分离样品的等电点、组成成分以及色谱柱分辨率等因素所控制的。通常使用多缓冲剂的pH间隔为1~3个单位,为提高分辨率,选择的实验pH范围应包括分离样品各组分的等电点,并有1/3~1/2柱长的吸附与解吸附的差异性。pH梯度范围确定后,多缓冲剂的类型与pH、多缓冲交换剂的类型与起始缓冲液的pH可参见表6-22进行确定。

表6-22 不同pH梯度范围的聚焦层析使用的多缓冲交换剂和多缓冲剂

 

续表

 

(二)多缓冲交换剂用量的选择

聚焦层析所需要的多缓冲交换剂的用量取决于样品的多少、性质和分辨率的要求等,一般情况,20~30mL的交换剂可够分离1~200mg蛋白质/pH单位,更加准确的用量要根据实验的分辨率来确定。

(三)多缓冲交换剂的预处理

多缓冲交换剂在装柱前要用10~15倍起始缓冲液充分平衡,起始缓冲液的pH一般需要高于pH梯度上限0.4个pH单位,以克服因起始缓冲液与洗脱液之间的pH差引起的波动。每种pH范围的多缓冲交换剂的相应起始缓冲液见表6-23。交换剂的反离子是Cl-或是其他高价阴离子,但这些反离子的pKa值必须比pH梯度的下限低两个pH单位。由于碳酸氢根离子会引起pH梯度的变化,所以所有的缓冲液使用前应进行抽气。当在pH5.5~6.5范围时,空气中的CO2会使pH梯度变平坦,用乙酸虽然能够防止这一现象的发生,但polybuffer74不能使用乙酸根作反离子。

(四)装柱

装柱的好坏将直接影响聚焦层析的分辨率。通常装柱过程如下:

①多缓冲交换剂按体积比1∶1悬于起始缓冲液中,进行脱气;

②将色谱柱竖直放置,关闭下端出口,柱中放入2~3mL起始缓冲液,将混匀的多缓冲交换剂悬液缓缓倒入柱中;

③打开下部开关,使多缓冲交换剂慢慢沉降,随后安装柱顶接头排尽管道中气泡;

④10~15倍柱体积的起始缓冲液平衡至流出液的pH和电导系数等同于起始缓冲液的值。

牛细胞色素C为红色,等电点10.5,不会被吸附在质量好的柱子上,因此,柱子的好坏可以用牛细胞色素C检测。

(五)上样与洗脱

为保证样品均匀地加到床面上,可在上样前在床顶部小心铺一层1~2cm厚的Sephadex G-25。聚焦色谱柱在pH梯度形成的初期,洗脱液中大部分离子会吸附到交换剂上,导致溶液中的离子强度降低,pH发生波动。因此上样前,应先加1~1.5倍床体积的洗脱液渗入柱中。样品加入后,通入缓冲液,在此过程pH梯度自动形成,梯度的上限由起始缓冲液确定,下限由洗脱液的pH确定。pH梯度的斜率由多缓冲剂洗脱液浓度决定,如果浓度高或是体积小,pH梯度斜率大,洗脱峰窄,反之,则斜率小,洗脱峰宽。洗脱流速一般设定在30~40cm/h。

(六)从纯化的蛋白质中除去多缓冲剂

(1)沉淀法 加入固体X铵到80%~100%饱和度,放置1~2h,使蛋白质沉淀。离心收集沉淀,用饱和X铵溶液洗两次,透析除去X铵。

(2)凝胶过滤法 凝胶色谱柱有除盐的作用,能将大分子蛋白质和小分子的物质分开。

(3)亲和色谱法和疏水色谱法 选择合适的色谱柱使蛋白质吸附,让多缓冲剂流出。

(七)多缓冲离子交换剂的再生

用2~3倍床体积的1mol/L NaCl淋洗除去结合物。当蛋白质杂质结合过于紧密时,可用0.1mol/L HCl洗涤,之后尽快平衡到较高的pH。

 

 

三、应用

 

聚焦色谱主要应用于蛋白质的分离纯化,其分辨率很高,可分离等电点差异0.02个pH单位的蛋白质。

(一)分离复杂组分蛋白质

以聚焦色谱法分离人血清载脂蛋白CⅢ亚型为例,将100mL PBE94混悬于100mL平衡缓冲液(25mmol/L咪唑、7.2mol/L尿素、1mmol/L Na2EDTA,pH7.4),装入1.5cm(内径)×75cm(长度)色谱柱,于4℃用10倍床体积平衡缓冲液平衡后,用溶解的极低密度脂蛋白中的载脂蛋白(apo VLDL)(含蛋白45~50mg)上柱,然后于4℃用1000mL洗脱缓冲液(polybuffer74∶8mol/L尿素=1∶8,pH4.0)洗脱,形成pH梯度。洗脱速度为20~25mL/min,每管2.5~3.0mL分段收集,测定各管280nm吸光度,收集各蛋白峰,经Bio-Rad的HTP凝胶柱色谱除去polybuffer74,最后对标准透析缓冲液(20mmol/L Tris-HCl、0.85% NaCl、0.01% Na2EDTA、0.01%叠氮化钠,pH7.4)于4℃透析,结果如图6-60所示。

 

图6-60 apo VLDL的聚焦色谱(pH4~7)洗脱曲线

(资料来源:方定志,1999)

由图6-60可见,apo VLDL经聚焦色谱后形成5个主要紫外吸收峰。根据测定各峰的pH、IEF和免疫印迹鉴定,第1峰为载脂蛋白C-Ⅰ,第2峰为载脂蛋白E,第3峰为载脂蛋白C-Ⅱ,第4峰为载脂蛋白C-Ⅲ1,第5峰为载脂蛋白C-Ⅲ2。

(二)鉴定酶的性质

利用聚焦色谱分离HIV-反转录酶时,色谱柱采用MonoPHR 5/20(5mL),起始缓冲液为0.025mol/L乙醇胺-乙酸(pH9.4),洗脱缓冲液为10% polybuffer96(pH6.0)。所得到色谱图如图6-61所示。

 

图6-61 聚焦色谱分离HIV-反转录酶的色谱图

(资料来源:Bbikhabhai R,1992)

此外,聚焦色谱蛋白峰洗脱时的pH与IEF的值相吻合,由此表明,聚焦色谱测定蛋白质的等电点为8。

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