王大虎

吉祥坊:灌注色谱-基本原理

王大虎 灌注色谱(perfusion chromatography)是20世纪90年代发展起来的一种新的色谱技术,它特别之处是采用了具有贯穿孔的颗粒新介质,解决了传统液相色谱“停滞流动相传质”问题,打破了流速、分辨率与容量间三角互相制约的关系,即在流速增加的情况下,柱容量、分辨率均不会降低,且压力不会升高,从而使快速分离生物大分子成为可能。

灌注色谱综合了对流色谱和扩散色谱的优点,代表了一种解决液相色谱传质问题的先进方法。它能以比一般HPLC快10~100倍的速度在较短的循环时间内进行生物大分子的分离,同时不明显损失分离度和柱容量。这一新方法还可以通过介质表面的衍生化反应进行多种模式的色谱分离。

王大虎 灌注色谱所采用的颗粒内部分布着两种结构的孔隙,一种是贯穿整个颗粒的特大孔,孔径为600~800nm,被称为穿透孔或贯穿孔;另一种是连接这些特大孔的较小一些的孔,孔径为50~150nm,孔深一般不超过1Lm(光通量单位),被称为连接孔或扩散孔。这种介质允许流动相流经其内表面,也即流动相灌注入介质颗粒中,被分离溶质会随流动相一起迅速接近介质的内孔表面,而不是靠浓度梯度进行扩散传质,因而能加快传质过程。同时,由于介质颗粒内部可利用反应的表面积大幅度增加,容量和分辨率也随之提高。因此,灌注色谱传质方式不同于传统液相色谱,如图6-62、图6-63以及表6-23所示。

王大虎
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图6-62 灌注色谱填料颗粒的示意图

1—穿透孔 2—扩散孔

(资料来源:熊博晖,1997)

 

图6-63 传统液相色谱和灌注色谱作用原理示意图

(资料来源:陈执中,2000)

表6-23 扩散与灌注的比较

折合板高h是间接评价分离介质性能的参数之一,它受多种因素影响,通常可表示为:

式中υ——通过柱床的流体折合流速,mL/min;

A——涡流扩散系数;

B——纵向扩散或轴向分子扩散系数;

C——停滞流动相传质阻力系数。

在高流速下,谱带展宽主要由C控制,此时式(6-11)可表示为:

式中µ——流动相的线速度,mL/min;

Deff——有效扩散系数;

dp——担体微粒的直径,µm;

c——系数。

王大虎 公式(6-12)表明,对于一般HPLC,流速越快,折合板高就越大,分离度就越低。

对于灌注色谱,当流速增加到一定程度时,介质的穿透孔内对流速度会超过扩散速度,传质方式由扩散转变为灌注,随着流速的不断增大,产量也不断增加,但并未引起谱带展宽(即分离度降低)。这是因为灌注色谱的Deff可以近似认为由对流因素[upore(穿透孔中的流速)×dp]来决定。对于给定的色谱柱和流速,穿透孔中的流速与床内流速的比值为常数α=upore/u,因而,Deff=upore×dp=uαdp,h=cdp/α。

因此,在灌注色谱中,分离度与表面液体速度和增加流速无关而保持常数,如图6-64所示。同时也说明,灌注色谱法是一种快速高分离度制备分离生物大分子的方法。

 

图6-64 折合板高h与流速u的关系

(资料来源:熊博晖,1997)

 

 

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