王大虎

吉祥坊:灌注色谱介质

目前所用的灌注色谱填料主要是POROS的系列,如图6-65所示,它是由美国Perseptive Biosystems公司开发、取名为POROS的系列灌注色谱。介质是由苯乙烯(ST)和二乙烯基苯(DVB)通过悬浮聚合、乳液聚合等方法制备的多孔型高分子微球。粒径规格为10Lm(H型)和20Lm(M型)两种。随着连接的官能团不同,又分为反相(R型)、强阴离子交换(Q型)和强阳离子交换(S型)等多种模式的介质类型。介质本身的孔隙率约50%,一般可耐压20MPa。

图6-65 液流通过POROS示意图

王大虎 (资料来源:夏小燕,1994)

这种介质的一个突出特点是孔内“停滞流动相的传质阻力”大大减小。这是因为颗粒内的传质过程主要靠穿透孔内的对流传递,生物大分子溶质能随流动相的液流迅速达到孔内的活性表面。虽然在穿透孔之间还存在若干扩散孔,它们不能形成快速对流传质,但这种孔的深度一般不超过1Lm,扩散程很短,不会造成明显的传质阻力,而且扩散孔的存在恰恰提供了较大的表面积和柱容量。

从灌注色谱介质的材料方面得知:①苯乙烯-二乙烯基苯聚合物的化学性质和机械性能非常稳定,容易选择和合成,能够与碳氢化合物很快交联,制成各种色谱模式的填料。②交联聚合反应发生在基质的表面,且能与水共存应用,这样既减少了溶剂的平衡时间,又阻止了介质的缩水作用。③此类树脂本身具有十分大的孔截面,保证了流动相顺利通过吸附剂的颗粒。

王大虎三、应用

灌注色谱法可用于蛋白质、多肽、酶、低聚糖、生物碱、蒽醌、苷类等复杂混合物的分析和分离纯化。

1.从茶薪菇中分离金属硫蛋白

以BioCAD 700E灌注色谱系统为平台,采用POROS 20HQ色谱柱分离纯化Cd诱导的茶薪菇金属硫蛋白。最终在优化的选择系统条件下(浓度20mmol/L,pH8.2 Tris-HCl缓冲液,流速5mL/min,0.6~1.2mol/L NaCl梯度洗脱)对Cd诱导的茶薪菇金属硫蛋白进行分离纯化,得到很好的分离结果,色谱图如图6-66所示。

图6-66 灌注色谱法分离纯化茶薪菇Cd-MT的色谱图

1—254nm光吸收值曲线 2—280nm光吸收值曲线 3—NaCl浓度变化曲线,峰Ⅰ是Cd—MT蛋白质峰

(资料来源:刘安玲,2002)

王大虎 2.从绿豆中分离抗菌蛋白

以BioCAD 700E灌注色谱系统为平台,采用POROS 20HS色谱柱分离纯化绿豆中抗菌蛋白。绿豆抽提液首先经过CM-Sephadex柱,得到的活性峰组分经浓缩、透析脱盐后,进行POROS 20HS色谱柱HPLC进一步纯化所得到的5个洗脱峰中,其中nsLTP峰为纯化的抗菌蛋白-非特异脂转移蛋白(nsLTP),结果如图6-67所示。

图6-67 P1组分在POROS 20HS柱上的nsLTP峰

曲线表示OD280,直线表示洗脱梯度;色谱条件:色谱柱0.75cm(内径)×7.5cm(长度),流速:3mL/min,A液:0.02mol/L,pH6.0的PBS,B液:0.02mol/L,pH6.0的PBS含0.7mol/L NaCl;检测波长280nm

(资料来源:汪少芸,2004)

将收集的nsLTP峰的样品进行SDS-PAGE(分离胶15%)电泳分析,结果如图6-68所示,仅在14ku以下有单一的带,这说明已经得到电泳纯的蛋白质。

图6-68 nsLTP SDS-PAGE图

电泳条件:15%分离胶,恒压:120V,考马斯亮蓝染色

(资料来源:汪少芸,2004)

 

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