大虎说事

王大虎:高效液相色谱

王大虎  高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)又称高速或高压液相色谱,是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术,随着不断改进与发展,目前已成为应用极为广泛的分离分析的重要手段。它是在经典液相色谱基础上,引入了气相色谱的理论,在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器,因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。目前HPLC已被广泛应用于对生物学和医药上有重大意义的分子物质(如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等)的分离和分析。

HPLC和经典液相色谱的分类大致相同,主要分为六大类:高效凝胶液相色谱、高效亲和液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效聚焦液相色谱、高效疏水液相色谱、反相高效液相色谱。高效液相色谱的工作原理是:利用高压输液泵将作为流动相的缓冲液泵入装有固定相的色谱柱,经进样阀注入样品,由流动相带入柱内,由于溶于流动相中的各组分经过固定相时,与固定相的配基发生相互作用(主要有吸附、分配、电荷、排阻、亲和)的大小、强弱不同,在固定相中滞留时间不同,不同的物质顺序离开色谱柱,从而先后从固定相中流出。在柱内各成分被分离后,通过检测器得到不同的峰信号,最后通过分析比对这些信号来判断待测物所含有的物质。

王大虎 二、固定相和流动相

HPLC固定相以承受高压能力来分类,可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以二氧化硅为基质,可承受700~1000MPa的高压,可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团,就是键合固定相,可扩大应用范围,它是目前使用最广泛的一种固定相。硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中,它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为350MPa。固定相按孔隙深度分类,可分为表面多孔型和全多孔型两类。表面多孔型固定相的基体是实心玻璃球,在玻璃球外面覆盖一层多孔性材料,如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酸胺等。全多孔型固定相由直径为10nm的硅胶微粒或氧化铝微粒凝聚成,这类固定相由于颗粒很细(5~10µm),孔仍然较浅,传质速率快,易实现高效、高速,特别适合复杂混合物的分离及痕量分析。

HPLC中流动相是液体,它不仅仅起到运载作用,同时对组分也具有亲和力,参与固定相对组分的竞争。所以,流动相的选择对样品的分离结果起到很大的作用。对流动相溶剂的要求是:

①对于目标样品,要具有合适的极性和良好的选择性,不与之发生反应。

王大虎
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②要与检测器匹配:对于紫外吸收检测器,应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时,溶剂对此辐射产生强烈吸收,此时溶剂被看作是光学不透明的,它严重干扰组分的吸收测量。

对于折光率检测器,所选择的流动相的折光率要与待测物的折光率有较大差别,以达最高灵敏度。

③高纯度:由于高效液相灵敏度高,对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳,或产生“伪峰”。痕量杂质的存在,将使截止波长值增加50~100nm。

④低黏度:若使用高黏度溶剂,势必增高压力,不利于分离。

⑤化学稳定性好:不与固定相发生反应或互溶、毒性低、价格便宜。

三、基本操作

王大虎(一)样品准备

样品和操作过程中所用的所有溶剂使用前都必须经尺寸为0.45µm(或0.22µm)的滤膜滤过,根据需要选择不同的滤膜,以除去杂质微粒,色谱纯试剂也不例外。所用流动相必须预先脱气,否则容易在系统内逸出气泡,影响泵的工作。

(二)装柱、样品前处理、上样、平衡、洗脱、柱的再生和保存

(1)装柱 色谱柱的性能除了与固定相性能有关外,还与填充技术有关。在正常条件下,当填料粒度>20µm时,干法填充较为合适;当颗粒<20µm时,湿法填充较为理想。大多数实验室使用已填充好的商品柱。

(2)样品前处理 样品配制时,塑料容器常含有高沸点的增塑剂,可能释放到样品液中造成污染,而且还会保留某些药物,引起分析误差。某些药物特别是碱性药物会被玻璃容器表面吸附,影响样品中药物的定量回收,因此必要时应将玻璃容器进行硅烷化处理。

除了注X可不用过滤外,样品在上样前都必须过滤,以除去杂质微粒。用滤膜过滤时,特别要注意分清有机相(脂溶性)滤膜和水相(水溶性)滤膜。有机相滤膜一般用于过滤含有机溶剂的样品,过滤水溶液时流速低或滤不动。水相滤膜只能用于过滤溶于水溶液的样品,严禁用于有机溶剂,否则滤膜会被溶解,溶有滤膜的样品溶液不得用于HPLC。

(3)加样 所有的样品均需经过前处理。不同的色谱柱的上样样品处理有所不同。如疏水色谱加样前,在样品溶液中要补加适量的盐类。

王大虎 (4)平衡 上样后,用平衡缓冲液平衡色谱柱,使样品充分吸附到色谱柱。

(5)洗脱 上样后,用洗脱缓冲液淋洗。所有的洗脱液均以能溶解被洗脱物质和不使其变性或失活为原则。不同的色谱柱分离不同物质洗脱方法有所不同。如凝胶色谱一般都以单一缓冲液(如PBS、Tris-HCl缓冲液等)或者盐溶液作为洗脱液,有时甚至也可以用蒸馏水作洗脱液。洗脱时流速要严格控制。而IEC则时常采用梯度溶液进行洗脱,溶液的梯度则是由盐浓度或酸碱度的变化形成的,洗脱液盐浓度由低到高淋洗,将样品组分洗脱下来。

(6)色谱柱的保存 在样品分析完毕后,在关机前最好用适当的溶剂(如超纯水、酒精)保存色谱柱,然后方可短时间或过夜保存。

如色谱柱要长时间保存,色谱柱必须存在于合适的溶剂状态下。对于反相柱可以储存于纯甲醇中,正相柱可以存于严格脱水后的纯正己烷中,离子交换柱可以储存于水(含防腐剂叠氮化钠或柳硫汞)中,并将X新色谱柱时附送的防尘防干裂塑料堵头堵上。对使用过含盐浓度较高的流动相的色谱柱,在储存之前,必须用超纯水替换掉原来的流动相后,再储存于合适的溶剂下。

(7)色谱柱的再生 因为HPLC柱是消耗品,随着使用时间或进样次数的增加,当出现色谱峰高降低,峰宽加大或出现肩峰时,一般来说可能是柱效下降。

①反相柱的再生:采用以甲醇∶水=95∶5(体积比)、纯甲醇、二氯甲烷等溶剂作流动相,顺次冲洗,每种流动相流经色谱柱的量为20~30倍色谱柱体积,然后再以相反顺序冲洗色谱柱。

②正相柱再生:顺次以正乙烷、异丙醇、二氯甲烷、甲醇作流动相冲洗色谱柱,每步注意平衡溶剂的顺序,不要颠倒。每种流动相流经色谱柱的量为20~30倍柱体积(因异丙醇的黏度较大,冲洗过程中请随时注意调整冲洗的流速),用甲醇冲洗完后,再以相反的顺序冲洗色谱柱。要注意上述溶剂必须严格脱水。

③离子交换柱的再生:长时间在高pH和高离子强度缓冲溶液中使用,将导致色谱柱离子交换能力降低。用稀酸缓冲溶液冲洗,可使阳离子柱再生;反之,用稀碱缓冲溶液冲洗,可使阴离子柱再生。

④亲和色谱柱的再生:当洗脱结束后,应连续用大量的洗脱液或高浓度的盐溶液彻底洗涤色谱柱,接着再用平衡缓冲液使色谱柱重新平衡,经过这样处理的色谱柱即可再次使用。

以上色谱柱的再生方法并不是绝对的标准方法,使用者可根据自己的实际经验和目的,选择合适的并能溶解柱内污染物的溶剂作流动相,按正方向或反方向的冲洗。但是需要指出的是,无论采用什么方法再生色谱柱,均不可能完全恢复柱效或其他参数至新柱水平。

王大虎(8)操作注意事项

①流动相均需色谱纯度,水用20mmol/L的去离子水。脱气后的流动相要小心振动,尽量不引起气泡。

②所有过柱的液体均需严格的过滤。

③在连接流动相管道、色谱柱和检测系统的时候,流动相管道、色谱柱和检测系统都不能带入气泡。将泵的吸头放入流动相时容易带入气泡,解决办法是每次放入流动相之后都要振荡几下;色谱仪系统里的气泡赶法是将X口管道压住,泵压升到临界值的时候放开,重复几次;接入色谱柱后气泡赶法是压住柱子一端X口,将泵压升到临界值的时候放开,重复几次。

 

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