王大虎

王大虎:紫外吸收法

王大虎  蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收峰在280nm处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质溶液的吸光度与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。

紫外吸收法可测定0.1~0.5mg/mL的蛋白质溶液,操作简便,测定迅速,不消耗样品,低浓度的盐,例如生化制备中常用的(NH4)2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱色谱洗脱液的快速连续检测,因为此时只需测定蛋白质浓度的变化,而不需知道其绝对值。

王大虎 此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差,干扰物质多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质,有一定的误差。故该法适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质时,会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表,再进行计算的方法,加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的,虽然经过校正,测定的结果还是存在一定的误差。

此外,进行紫外吸收法测定时,由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化,因此要注意溶液的pH,测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。吸光度最好在0.05~1.0,在0.3附近的精度最高。浑浊溶液应采取过滤(0.2µm过滤)或离心使溶液澄清,或者用A280-A310进行修正。

(一)280nm的光吸收法

测定蛋白质溶液在280nm的吸光度值是最常用的紫外吸收法。

在近UV区,蛋白质的吸光度主要取决于其中的酪氨酸和色氨酸残基的含量,在一定程度上,还取决于苯丙氨酸和二硫键的含量。因此,不同蛋白质的吸光度变化较大,大多数1mg/mL的蛋白质溶液的A280为0.5~1.5(某些富含酪氨酸的绵状蛋白达到4)。对于某一特定蛋白质,在一定浓度范围内,测定比吸光值,可以比较准确计算出蛋白质浓度。

选用一种与待测蛋白质的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白质作为标准蛋白质,配制成浓度为1.0mg/mL的溶液。常用的标准蛋白质为牛血清白蛋白(BSA)。

由于不同蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量不同,所处的微环境也不同,不同蛋白质溶液在280nm的吸光度也有不同;另外,由于蛋白质的紫外吸收峰常因pH的改变而有变化,用紫外吸收法时,要注意溶液的pH(最好与标准曲线制定时的pH一致)。所以此法不是严格的定量方法,适用于粗提蛋白质的测定。许多在紫外区引起光吸收的物质会干扰测定,若存在非蛋白质类的发色基团(如血红素、吡哆醛)则A280会增大。在280nm下核酸的消光大约是蛋白质的10倍,有强干扰作用。

测定时根据需要,对待测蛋白质溶液用合适的缓冲液(无紫外吸收)稀释,确保测量精度。用空白对照和石英比色皿在紫外分光度计上直接读取待测蛋白质溶液在280nm的吸光度,控制蛋白质浓度在0.1~1.0mg/mL,检测的灵敏度为0.2~2.0mg/mL,比色皿的最小测量体积为0.1mL。

王大虎 (二)280nm和260nm的吸收差法

核酸对紫外光有很强的吸收,在280nm处的吸收比蛋白质强10倍(每克),但核酸在260nm处的吸收更强,其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm处的吸光度是280nm处的2倍,而蛋白质则相反,280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。通常情况下,纯蛋白质的吸光度比值:A280/A260≈1.8,纯核酸的吸光度比值:A280/A260≈0.5。

含有核酸的蛋白质溶液,可分别测定其A280和A260,由此吸收差值,用下面的经验公式,即可算出蛋白质的浓度:

 

此经验公式是通过一系列已知不同浓度比例的蛋白质(酵母烯醇化酶)和核酸(酵母核酸)的混合液所测定的数据来建立的。

采用相似的吸光度差异的原理,还可采用下面的公式来测定含有核酸的蛋白质样品:

王大虎
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此外,也可先计算出A280/A260的比值后,从表8-1中查出校正因子“F”值,同时可查出样品中混杂的核酸的百分含量,将“F”值代入,再由下述经验公式直接计算出该溶液的蛋白质浓度。

表8-1 紫外吸收法测定蛋白质含量的校正因子

 

 

式中A280——该溶液在280nm下测得的吸光度;

d——石英比色皿的厚度,cm;

N——溶液的稀释倍数。

王大虎 (三)215nm与225nm的吸收差法

低浓度的蛋白质会由于比色皿的吸收,而从溶液中损失。采用高离子强度,或在含有非离子表面活性剂的缓冲液中测定,有助于防止这种损失。

通常不用280nm的光吸收测定蛋白质的稀溶液浓度,而是利用215nm与225nm吸收值之差,通过标准曲线来测定。用已知浓度的标准蛋白质,配制成20~100mg/mL的一系列差5.0mL的蛋白质溶液,分别测定215nm和225nm的吸光度,并计算出吸收差:吸收差D=A215-A225。以吸收差D为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标,绘出标准曲线。再测出未知样品的吸收差,即可由标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度。在特定条件下,可以精确测定蛋白浓度为5µg/L的溶液。

本方法在蛋白质浓度20~100mg/mL范围内,蛋白质浓度与吸光度成正比,当pH在4~8,蛋白质在215nm~225nm的吸光度与pH无关。NaCl、(NH4)2SO4以及0.1mol/L磷酸、硼酸和Tris等缓冲液,都无显著干扰作用,但是0.1mol/L NaOH、0.1mol/L乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥酸等缓冲液的215nm光吸收值较大,必须将其浓度降到0.005mol/L以下才无显著影响。采用此法必须谨慎,以防干扰。用如下经验公式:

 

(四)238nm的光吸收法(肽键测定法)

肽键在远紫外区有强吸收,最大吸收峰λmax在190nm,但由于氧的吸收和分光光度计的输出困难,一般选用238nm测定。蛋白质溶液在238nm处的光吸收强弱与肽键的含量成正比。用标准蛋白质溶液配制系列浓度(50~500µg/mL)的蛋白质溶液5.0mL,测定光吸收值A238,以A238为纵坐标,蛋白质含量为横坐标,绘制标准曲线。常用0.9%NaCl溶液适当稀释蛋白质溶液进行测定,再由标准曲线求得未知样品的浓度。

这种测定方法简单、灵敏,样品可回收,对于不同蛋白质的光吸收变化很小。蛋白质溶液进行柱色谱分离时,用238nm检测洗脱液的蛋白质峰位,比280nm吸收法灵敏。但是测定时需要在远紫外区校正分光光度计的精度,许多缓冲液和多种有机化合物,如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类和过氧化物、血红素等都有干扰作用。最好用无机盐、无机碱和水溶液进行测定。含有有机溶剂的样品,经蒸干或其他方法去除干扰物质后,用水、稀酸或稀碱溶解后测定。

 

 

三、双缩脲法

 

双缩脲(NH2—CO—NH—CO—NH2)是两个分子脲经180℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反应(图8-1)。因为蛋白质中有多个肽键,也能与Cu2+发生双缩脲反应(图8-2),且紫色络合物颜色的深浅与蛋白质含量的关系在一定范围内符合比尔定律,而与蛋白质的氨基酸组成及分子质量无关,所以可用双缩脲法测定蛋白质的含量。

 

图8-1 双缩脲反应

 

图8-2 铜双缩脲复合物分子结构

双缩脲法常用于0.5~10mg/mL蛋白质溶液的测定,能测出的蛋白质含量需在约0.5mg以上。

干扰这一测定的物质主要有:硫醇、某些氨基酸以及具有肽性质的缓冲液,如Tris缓冲液等,因为它们产生阳性呈色反应,Cu2+也容易被还原,有时出现红色沉淀,蔗糖、甘油也干扰测定。可用沉淀法除去干扰物,即用等体积10%冷的三氯乙酸沉淀蛋白质,然后弃去上清液,再用已知体积的1mol/L NaOH溶解蛋白质。

此法的优点是使用试剂价廉易得,操作简便,较快速;反应主要涉及肽键,受蛋白质特异性影响较小,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近;以及干扰测定的物质少。主要的缺点是灵敏度差,所需样品量大。

因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定。因为核酸等其他非蛋白质成分不干扰显色,这对早期提纯阶段的测定非常有用。在复杂生物X中需要快速测定其中蛋白质的含量时,最常用此法。

 

 

四、Folin-酚试剂法(Lowry法)

 

Folin-酚试剂法的显色原理与双缩脲方法是基本相同,只是加入了第二种试剂,即Folin-酚试剂,以增加显色量,从而提高了检测蛋白质的灵敏度。反应过程分为两步,第一步:在碱性溶液中,蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+作用生成蛋白质-Cu2+复合物;第二步:蛋白质-Cu2+复合物中所含的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸,生成蓝色的化合物。该呈色反应在30min内即接近极限,并且在一定浓度范围内,蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系,故可用比色的方法确定蛋白质的含量。

此法可检测的最低蛋白浓度达5µg/mL,通常测定范围是20~250µg/mL。此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。

此法是在双缩脲法的基础上引入Folin-酚试剂,对双缩脲反应发生干扰的离子,同样容易干扰Lowry反应,而且对后者的影响还要大得多。干扰双缩脲反应的基团,如—CO—NH2,—CH2—NH2,—CS—NH2,—CRH—NH2,—CH2—NH—CHNH2,—CH2OH,—CHOH—CH2—NH2以及在性质上是氨基酸或肽的缓冲剂,如Tris缓冲剂以及糖类、X铵、巯基化物均可干扰Folin-酚反应。此外,所测的蛋白质样品中,若含有酚类、柠檬酸,均对此反应有干扰作用。浓度较低的尿素(0.5%)、胍(0.5%)、X钠(1%)、硝酸钠(1%)、三氯乙酸(0.5%)、乙醇(5%)、X(5%)、丙酮(0.5%)等溶液对显色无影响,但这些物质在所测样品中含量较高时,必须作校正曲线。若所测的样品中含X铵,只需增加Na2CO3-NaOH浓度,即可显色测定。若样品酸度较高,也需提高Na2CO3-NaOH的浓度1~2倍,这样即可纠正显色后色浅的弊病。

此法的优点是操作简单,不需特殊仪器设备,灵敏度高,较紫外吸收法灵敏10~20倍,较双缩脲法灵敏100倍。缺点是费时间较长,要精确控制操作时间,标准曲线也不是严格的直线形式,且专一性较差,干扰物质较多。

Folin-酚试剂法,是目前蛋白质定量测定中最灵敏和应用最广泛的方法之一。

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