大虎说事

王大虎:标准蛋白质溶液

精确称取分析纯牛血清白蛋白或酪蛋白25mg,用少量蒸馏水完全溶解后,转移至100mL容量瓶中,准确稀释至刻度,使蛋白质浓度为0.25mg/mL。非分析纯牛血清白蛋白或酪蛋白预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度配制成0.25mg/mL蛋白质溶液。牛血清白蛋白溶于水若浑浊,可改用0.9%NaCl溶液溶解。

王大虎 3.待测蛋白质溶液

为使待测蛋白质样品的浓度在标准曲线测试范围内,应将过浓或过稀的样品稀释或浓缩适当倍数。

4.仪器

可见光分光光度计,比色杯,100mL容量瓶,试管及试管架,0.5mL、1mL及5.0mL移液管,秒表,漩涡混合器等。

(二)操作方法

1.制作标准曲线

取14支干试管分成两组,按表8-2平行操作。

表8-2 标准曲线制作表

 

注:*进行测定时要根据蛋白质浓度的不同选用不同的测定波长:若蛋白质含量高时(25~100µg/mL)在500nm波长处进行测定,含量低时(5~25µg/mL)在755nm波长处进行测定。

以光密度为纵坐标,标准蛋白质溶液浓度为横坐标,在坐标纸上绘制标准曲线。

王大虎 2.样品测定

取4支试管分成两组,按表8-3平行操作。

表8-3 样品测定表

3.计算

根据样品管溶液测定的平均光密度值,在绘制好的标准曲线图中查出对应的蛋白质浓度(µg/mL)

待测样品蛋白质含量(µg/mL)=光密度值对应的标准曲线蛋白质浓度/测定时用的样品体积(mL)

(三)改良的简易Folin-酚试剂法

对Folin-酚试剂法改良的简易方法中,包括试剂和操作步骤的改良,具体如下。

王大虎 1.试剂

试剂甲:碱性铜试剂溶液中,含0.5mol/L NaOH、10%Na2CO3、0.1%酒石酸钾和0.05%CuSO4,配制时注意CuSO4用少量蒸馏水溶解后,最后加入。

试剂乙:与前面的基本法相同。临用时加蒸馏水稀释8倍。

标准蛋白质溶液:同基本法。

2.操作步骤

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测定标准曲线与样品溶液的操作方法与基本法相同。只是试剂甲改为1mL,室温放置10min后。试剂乙改为4mL,在55℃恒温水浴中保温5min。用流动水冷却后,在660nm下测定其吸光度。

改良的快速简易法,可获得与Folin-酚试剂法(即Lowry基本法)相接近的结果。

五、二喹啉甲酸法(BCA法)

由Smith等首先提出的二喹啉甲酸(BCA)检测法,是Lowry测定法的一种改进,反应简单而且没有太多的干扰物影响。反应原理和Lowry法类似,蛋白质分子中的肽键在碱性条件下能与Cu2+生成络合物,同时将Cu2+还原成Cu+。二喹啉甲酸及其钠盐是一种溶于水的化合物,在碱性条件下,可以和Cu+结合生成深紫色的化合物,这种稳定的化合物在562nm处具有强吸收值,并且化合物颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。故可用比色的方法确定蛋白质的含量。

加入BCA强化双缩脲反应的BCA法与加入Folin-酚试剂强化双缩脲反应的Lowry法相比,BCA法的操作更简单,试剂更加稳定,几乎不受干扰物质的影响,灵敏度更高,有标准检测和微量检测两种类型,检测灵敏度分别为10~1200µg/mL和0.5~10µg/mL。该方法不受去垢剂、变性剂(脲和胍基盐酸)影响,这也是与Bradford法相比BCA法的显著优点。但BCA法对还原糖更加敏感。

(一)材料仪器

1.BCA试剂一(适用于样品蛋白含量为100~1000µg/mL的检测)

试剂A:分别称取10g BCA(1%),20g Na2CO3·H2O(2%),1.6g Na2C4H4O6·2H2O(0.16%),4g NaOH(0.4%),9.5g NaHCO3(0.95%),加蒸馏水至1L,用NaOH或固体NaHCO3调节pH至11.25。试剂B:取2g CuSO4·5H2O(4%),加蒸馏水至50mL。

BCA试剂一:取50倍体积试剂A与1倍体积试剂B混合均匀,室温下可稳定一周。

BCA试剂二(适用于样品蛋白含量为0.5~10µg/mL的检测)

试剂A:称取8g Na2CO3·H2O,16g Na2C4H4O6·2H2O(0.16%),16g NaOH,加蒸馏水至1L,用NaOH调节pH至11.25。试剂B:取40g BCA,加蒸馏水至1L。试剂C:2.0g CuSO4·5H2O,加蒸馏水至50mL。

BCA试剂二:取1倍体积试剂C与25倍体积试剂B混合均匀,再加入26倍体积试剂A。

王大虎 2.标准蛋白质溶液

精确称取分析纯牛血清白蛋白或酪蛋白100mg,用少量蒸馏水完全溶解后,转移至100mL容量瓶中,准确稀释至刻度,使蛋白质浓度为1.0mg/mL。非分析纯牛血清白蛋白或酪蛋白预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度配制成1.0mg/mL蛋白质溶液。

3.待测蛋白质溶液

为使待测蛋白质样品的浓度在标准曲线测试范围内,应将过浓或过稀的样品稀释或浓缩适当倍数。

4.仪器

可见光分光光度计、比色杯、恒温水浴锅、容量瓶、试管及试管架、移液管、漩涡混合器等。

(二)操作方法

1.制作标准曲线

取14支干试管分成两组,按表8-4平行操作。

表8-4 标准曲线制作表

 

以光密度为纵坐标,标准蛋白质溶液浓度为横坐标,在坐标纸上绘制标准曲线。

2.样品测定

取4支试管分成两组,按表8-5平行操作。

表8-5 样品测定表

 

注:对于样品蛋白质含量在100~1000µg/mL的样品,取样100µL,使用BCA试剂一,保温30min。对于样品蛋白质含量在0.1~10µg/mL的样品,取样1mL,使用BCA试剂二,保温1h。空白管与绘制标准曲线使用的BCA试剂与样品测试管使用的BCA试剂一致。

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