王大虎

王大虎:考马斯亮蓝法(Bradford法)

1976年由Bradford建立的考马斯亮蓝法(Bradford法),是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点,因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。

考马斯亮蓝G-250即二甲花青亮蓝,是一种甲基取代的三苯基甲烷,每个分子含有一个—SO3H基团,偏酸性,存在着两种不同的颜色形式,红色和蓝色。在酸性溶液中,可以通过范德华力与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合,使染料的最大吸收峰从465nm移动到595nm,溶液的颜色也变为蓝色,染料和蛋白质的结合量在一定浓度下与595nm处的吸收值线性相关,其蛋白质结合反应在2min内即可完成,而反应生成的复合物可在1h内比较稳定地存在于溶液中,因此,通过测定595nm处光吸收的增减量可知与其结合蛋白质的量。

Bradford法的突出优点是:灵敏度高,最低检出量为1µg蛋白质;测定快速、简便,只需加一种试剂,完成一个样品的测定只需要数分钟,不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间;干扰物质少。此法的缺点是:由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差;检测试剂因储存时间会导致吸光度的变化,所以每次检测必须作标准曲线,标准曲线也有轻微的非线性,因而不能用比尔定律进行计算,而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度;仍存在一些物质干扰此法的测定;背景较深等。总之,此方法试剂简单、经济,测定简便、快速,灵敏度高,受干扰小,可测范围广,是一种测定蛋白质含量的常用方法。

使用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量时,对于可见光分光光度计的比色杯,注意不要使用石英、硅胶比色杯,因为染料会结合在此类材料上,不易洗去。可用塑料或玻璃比色皿,使用后立即用少量95%的乙醇或去垢剂荡洗,以洗去染色;塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。

总之,对于以上蛋白质定量方法,可以简单比较和总结,如表8-6所示。

表8-6 蛋白质测定方法的比较

 

王大虎  第二节 蛋白质提纯后的纯度标准

一、纯度标准

蛋白质提纯以后需要有指标来说明它的纯度,从原则上看有许多制备纯化蛋白质的方法是可以将它们改成分析方法的,如各种分析的电泳、微量凝胶过滤法、各种色谱、结晶出现、生物活力及免疫分析等。用一种方法一个条件来分析蛋白质的纯度是不够的。由于蛋白质数量多,性质相似者在所难免,一个条件下两个蛋白质不能分开的可能性是很大的,一般均希望用两种以上的方法来分析蛋白质的纯度。只有一种检定方法时应该用两种以上条件来鉴定。对蛋白质纯度的要求因工作需要而异,生物制品考虑制品体内的副作用,物理化学研究要求不干扰对象的物化性质,化学结构分析要使杂质含量低于分析方法的灵敏度等均要作具体分析。

确定一个蛋白质样品的纯度,往往受很多因素的限制。通常,污染蛋白质的含量极低,当它低于所用分析方法的检测极限时,就很难从蛋白质样品中检测出。单独使用某种检测方法时,污染蛋白质与蛋白质样品的表现行为类似,同样会被误认为是均一的。用低分辨率方法证明是纯的样品,改用高分辨率方法时就可能证明它是不纯的,而且每一种方法只能描述样品在某一方面的特质。因此,只用一种方法作为纯度检验的标准是不可靠的,必须选择多种检验纯度的方法。理论上只有当样品通过了所有的检验,才能确定这个样品是纯的。

确定蛋白质(或多肽)样品的纯度标准大致如下:即分子大小是否均一,电荷是否均一,是否具有恒定的氨基酸组成,是否具有单一的N末端和C末端残基,进一步纯化时生物活性是否有提高及能否结晶等。如果都是单一的氨基酸残基,则含杂质可能为1/160000。上述几条是较严格的要求,很难全都达到。通常以电泳时呈现一条带以及末端残基鉴定是单一的情况下即可进行顺序测定。

最好的纯度标准是:建立多种分析方法,从不同的角度来测定蛋白质样品的均一性。任何单独一种方法的鉴定结果只能作为蛋白质均一性的必要条件,而非充分条件。样品的纯度最终取决于所用检测方法的类型和分辨能力。

二、常用的纯度检测方法

通常用于蛋白质样品纯度检测的方法有物理化X,如电泳、沉降、HPLC和溶解度分析等。此外,化学分析法以及利用生物活性、免疫学特性的方法也在纯度检测中使用。对于不同用途的蛋白质样品,根据所要求的不同纯度,选用适宜的检测方法。一般来说,对样品的纯度要求越高,应当采用越多的检验方法。下面介绍几种检验纯度的方法。

王大虎 1.电泳法

此法最常用于蛋白质纯度鉴定。目前采用的电泳分析有PAGE和SDS-PAGE、IEF、CE等。样品在凝胶电泳上显出一条区带,只说明样品在荷质比(电荷/质量)方面均一。如果一系列不同pH条件下的电泳都为一条带,则结果更可靠。SDS-PAGE上出现一条带只能说明样品在分子质量方面是均一的,而且只适用于含有相同亚基的蛋白质。IEF是基于等电点不同来分辨的,它有很高灵敏度。需要注意的是,蛋白质有时能和载体两性电解质结合,改变其等电点。由于载体两性电解质是多种不连续组分构成的,因而在凝胶上会出现多条微小的带,当IEF凝胶上只出现一个带时,是均一性的很好证明,但出现多条微小带时,却不能说该样品一定是不均一的。含脲的凝胶电泳对检测在低离子强度下不溶的蛋白质的纯度非常有用。样品先溶解在脲中、完全变性,然后按电荷和亚基大小来分离。双向电泳也是广泛采用的技术,对分析纯化酶来说,只需单向电泳就可以了。

王大虎 2.色谱法

用线性梯度的IEC或凝胶过滤色谱分析样品时,纯蛋白质样品的洗脱图谱上呈现出单一的对称峰,具有恒定的比活。如果洗脱的各部分比活都相同,则表明样品在色谱性质上均一。分析型HPLC常用于多肽、蛋白质纯度的鉴定,分辨率接近于电泳法。

3.免疫化X

免疫技术,如免疫扩散、免疫电泳、双向免疫电泳、放射免疫分析等,都是鉴定蛋白质纯度的有用方法。很多蛋白质和某些多糖、脂类一样,都有抗原性,给适当动物注射时,X特异性抗体的形成。注射均一性的物质只形成一种特异性抗体,而注射几种具有抗原性物质时则产生几种抗体,此法只适用于杂质为抗原性物质。放射免疫分析法和酶联免疫分析法发展迅速、应用广泛,用于各种检测中,几乎普及于生物体内各种微量成分的测定,灵敏度很高。其中放射免疫分析法存在有损操作人员的健康和废弃物污染的可能,酶联免疫分析法、发光免疫分析法和蛋白质印迹等方法则无此缺点。

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4.生物活性法

对酶来说,酶活力是一个很好的纯度试验指标。因为随着杂质的除去,比活增加,当样品不能进一步纯化时,比活达到恒定的最大值。此外,污染蛋白质生物活力的消失也是一个间接的纯度评价标准。如果蛋白质含有容易测到的金属,或紧密结合的辅助因子,那么,其含量在纯化过程中将增加。当样品达到均一状态时,其含量也就恒定了。

利用蛋白质的特殊功能特性(如激素、酶、氧载体等)检验纯度,有很高灵敏度,有时能检出浓度低到10-6级的杂质,比许多理化方法的灵敏度要高得多。

王大虎 5.蛋白质化学结构分析法

随着蛋白质分析技术的进步,末端基团的测定方法等也逐渐用于蛋白质纯度的鉴定。对于一个纯蛋白质来说,通过N末端的定量分析可以发现,每摩尔蛋白质应当有整数摩尔的N末端氨基酸。少量其他末端基团的存在,常常表示存在着杂质。如果只是定性地测定N末端,那么此法就只适用于仅有一个肽链的蛋白质。

对样品进行总的氨基酸分析,也是检验纯度的一个方法。对一个纯蛋白质而言,应当发现所有的氨基酸都成整数比,如果含有辅因子的话,辅因子也应计算在内。若有精确、灵敏、快速的氨基酸定量分析仪可供利用的话,此法常被用来鉴定蛋白质的纯度。最终的纯度标准,当然是唯一的氨基酸序列,但很少用它来鉴定纯度。

6.超速离心沉降分析法

凝胶电泳可检测出主要成分1%的杂质,但有些样品不适于用电泳法分析。例如,脂蛋白和其膜束缚的蛋白质的电泳行为异常,而且其结构的完整性需在去垢剂存在下才能保持。这时最好用超速离心法。

纯的蛋白质在离心场中以单一的沉降速度移动,在离心管中均一蛋白质溶液只形成一个界面。分步取出离心管中的样品,管号对样品浓度作图后,组分的分布是对称的,则表明样品是均一的。用此法检测纯度所需样品用量少、时间短,但由于沉降系数主要是由分子大小和形状决定的,而与化学组成无关,因此灵敏度较差,难以检测出微量杂质。

7.溶解度分析法

纯的蛋白质在一定的溶剂系统中具有恒定的溶解度,而不依赖于溶液中未溶解固体的数量。用恒浓度法鉴定蛋白质纯度在理论上是严格的,在实验方法上简单易行。在严格规定的条件下,以加入的固体蛋白质对溶解的蛋白质作图。纯蛋白质的溶解度曲线只呈现一个折点,折点前的直线斜率为1,折点后的斜率为0。而不纯的蛋白质的溶解度曲线常呈现2个或2个以上的折点。

8.分光光度法

纯蛋白质的A280/A260应为1.75,因此,可用分光光度法检查蛋白质制剂中有无核酸等污染物的存在。

总之,检验纯度的最常用方法是电泳法,然后才是其他方法。如果对样品纯度的要求越高,则用来检验纯度的方法应当越多,而且对所得到的数据的解释越应当小心谨慎。

随着分析技术水平的不断提高,经常还将一种曾认为是纯的蛋白质分离成几个组分,即出现微不均一性的现象。这种不均一性可分为两类情况。一类是在蛋白质肽链合成后在加工中产生的,如糖蛋白由于含糖量不同,它们的电泳行为常表现很大差异,又如赖氨酸的甲基化,丝氨酸的磷酰化以及磺酰化等,也会产生电泳行为的不均一性;还有一些则是在分离纯化过程中人为产生的,如脱酰胺等,这种不均一性对蛋白质顺序分析不会带来太大的困难。另一类不均一性是由于基因家族产生的,它们之间的不同表现为个别氨基酸的替换、N末端或C末端肽段的缺失等,这种不均一性会给蛋白质分析带来很大困难。但蛋白质分子的一部分分子的一个侧链酰基变成了羧基,糖蛋白的配基相差一个单糖,这种情况下蛋白质化学结构仍是单元蛋白质,生物功能也无任何影响。此外还有同工蛋白质,它的功能相同但化学结构不同,从功能上看纯而从结构上看不纯。因此,纯度属相对的概念,具体情况要多做具体分析,不能简单化。

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