大虎说事

王大虎:蛋白质纯品的储存

蛋白质的保存方法与其分子稳定性有很大关系,主要有干态储存和液态储存两种。不论是干态储存还是液态储存,均应避免长期暴露于空气中,防止微生物的污染。温度对蛋白质的稳定性影响很大,低温保存在大多数情况下是有利的。蛋白质的半衰期在低温下可延长。通常要依据蛋白质的用途来决定其储存条件是在4℃、-20℃、-80℃或-200℃(液氮)下。

短期储存时(从一天至一周),蛋白质溶液在以下情况可储存于4℃,长期储存时(超过一周),要根据不同蛋白质的稳定性来选择合适的方法。在确定某种方法大量保存某种蛋白质之前,应当实验以下几种不同的方法。

王大虎 一、干态储存

干燥的制品一般比较稳定,如制品含水量很低,在低温情况下蛋白质分子活性可在数月甚至数年无显著变化。储存方法也很简单,只将干燥后的样品置于干燥容器内(内装有干燥剂)密封,保存于0~4℃冰箱中即可。有时为了取样方便和避免取样时样品吸水和污染,可先将样品分装于许多小瓶中,每次用时只取出1瓶。

对许多蛋白质而言,冻干是长期储存最安全和最有效的办法,但是对极少数蛋白质来说一个明显的缺点是失活和不能再溶解。因此,在将所有的蛋白质以此方法储存之前必须取少量的样品进行试验。

二、液态储存

液态储存的优点是使样品免去干燥这一步骤,蛋白质分子的生理活性和结构破坏较少;缺点是需要较严格的防腐措施,储存时间不能太长,如样品量大时封装运输不方便,实验室常采取少量安瓿封存法。液态储存注意事项如下:①样品不能太稀,必须浓缩至一定浓度后才能封装储存,样品太稀时易引起蛋白质变性作用。②一般需加入防腐剂和稳定剂,常用防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。常用的稳定剂有X铵、蔗糖、甘油等,酶也可加入底物和辅酶以提高其稳定性。此外,钙、锌、硼酸等盐溶液对某些酶也有一定保护作用。③储存温度要求较低,大多数在0℃左右冰箱保存即可,有的则要求更低温度。另有文献报道某些蛋白质和酶在低温中反而引起变性。故应分情况对待,不能一概而论。

总之,蛋白质的贮藏和保存,温度和水分是影响稳定性的两个主要因素。其次,各种稳定剂的应用是否适当关系也很大。实际应用时应全面加以考虑。目前常用的液态储存蛋白质的方法包括:

①一种最简单的方法是在X铵溶液中将沉淀以悬浮形式保存于4℃下。

②另一种方法,X铵沉淀蛋白质后于20000r/min离心20min,在液氮中冷冻,然后储存于-80℃或更低的温度下。

③液氮冻存蛋白质。利用液氮冻存蛋白质,必须最大限度减少蛋白质溶液中各相的分离,以避免沉淀的发生或局部缓冲液浓度的增高而引起pH在±3个单位中的波动。高浓度的蛋白质(2mg/mL)可提供自我缓冲作用,在液氮中冷冻蛋白质可减少冻结所需的时间。其合适的方法是:用巴斯德滴管或自动加样枪将50µL的蛋白质液体小滴滴入液氮中。滴入的速度要慢,以防止蛋白质溶液未形成小滴。对大体积的蛋白质溶液的冷冻,可使用泵或自动滴液器来操作。在完成后,从液氮中将这些沉淀舀出迅速放入储存管中以防液滴的溶解,然后将其储存于-80℃或液氮中。在实验中可方便的倒出所需用量的蛋白质液滴,从而避免多次反复冻融所引起的蛋白质损害。

④通常,甘油可有效的提高蛋白质的稳定性。先配置成50%的甘油储存液,工作液中含20%~30%的甘油不会引起操作困难。在蛋白质溶液中加入甘油可使溶液在低温非冷冻状态下保存。

王大虎
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第四节 蛋白质的冻干

王大虎 一、基本原理

冻干即冷冻干燥,是指通过升华从冻结的生物产品中去除水分或其他溶剂的过程。升华指的是溶剂,比如水,像干冰一样,不经过液态,从固态直接变为气态的过程。冷冻干燥得到的产物称作冻干物。

冰在升华时要吸收热量,引起产品本身温度的下降而减慢升华速度。为了增加升华速度,缩短干燥时间,必须要对产品进行适当加热。整个干燥是在较低的温度下进行的。

传统的干燥会引起材料皱缩,破坏细胞。冷冻干燥在低温下进行,在冰冻干燥过程中样品的结构不会被破坏,因为固体成分被在其位置上的坚冰支持着。在冰升华时,它会留下孔隙在干燥的剩余物质里。干燥后的物质疏松多孔,呈海绵状,加水后溶解迅速而完全,几乎立即恢复原来的性状。这样就保留了产品的生物和化学结构及其活性的完整性,使蛋白质不会发生变性或失去生物活力,因此在蛋白质研究以及医药生产上得到广泛的应用。

王大虎 二、共熔点

溶液并不是在某一固定温度时凝结,而是在某一温度范围内凝结,当冷却时开始析出晶体的温度称为溶液的冰点,而溶液全部凝结的温度叫做溶液的凝固点,因为凝固点就是融化的开始点(即熔点),对于溶液来说也就是溶质和溶媒共同熔化的点,所以又称作共熔点。可见溶液的冰点与共熔点是不相同的。共熔点才是溶液真正全部凝成固体的温度。

由于冷冻干燥是在真空状态下进行,只有产品全部冻结后才能在真空下进行升华,否则有部分液体存在时,在真空下不仅会迅速蒸发,造成液体的浓缩使冻干产品的体积缩小,而且溶解在水中的气体在真空下会迅速冒出来,造成像液体沸腾的样子,使冻干产品鼓泡,甚至冒出瓶外。为此冻干产品在升华开始时必须要冷到共熔点以下的温度,使冻干产品真正全部冻结。

在冻结过程中,从外表的观察来确定产品是否完全冻结成固体是不可能的,靠测量温度也无法确定产品内部的结构状态。而随着产品结构发生变化时电性能的变化是极为有用的,特别是在冻结时电阻率的测量能使我们知道冻结是在进行还是已经完成了,全部冻结后电阻率将非常大。因为溶液是离子导电,冻结时离子将固定不能运动,因此电阻率明显增大。而有少量液体存在时电阻率将显著下降。因此测量产品的电阻率将能确定产品的共熔点。

共熔点的数值从0~40℃不等,与产品的品种、保护剂的种类和浓度有关。

王大虎  三、冻干程序

冷冻干燥的程序是:在冻干之前,把需要冻干的产品分装在合适的容器内,一般是玻璃瓶或安瓿瓶,装量要均匀,蒸发表面尽量大而厚度尽量薄些;然后放入与冻干箱尺寸相适应的金属盘内。装箱之前,先将冻干箱进行空箱降温,然后将产品放入冻干箱内进行预冻,抽真空之前要根据冷凝器冷冻机的降温速度提前使冷凝器工作,抽真空时冷凝器应达到-40℃左右的温度,待真空度达到一定数值后,即可对箱内产品进行加热。一般加热分两步进行,第一步加温不使产品的温度超过共熔点的温度,待产品内水分基本干完X行第二步加温,这时可迅速地使产品上升到规定的最高温度。在最高温度保持数小时后,即可结束冻干。

整个升华干燥的时间12~24h,与产品在每瓶内的装量、总装量、玻璃容器的形状、规格,产品的种类,冻干曲线及机器的性能等有关。

王大虎 (一)产品的预冻

产品在进行冷冻干燥时,需要装入适宜的容器,然X行预先冻结,才能进行升华干燥。产品的分装通常有散装和瓶装两种方式。散装可以采用金属盘、饭盒或玻璃器皿;瓶装采用玻璃瓶和安瓿瓶。各种容器在分装之前要求清洗干净并进行灭菌处理。需要冻干的产品需配制成一定浓度的液体,为了能保证干燥后有一定的形状,物质含量为10%~15%最佳。

产品分装到容器有一定的表面积与厚度之比。表面积要大一些,厚度要小些。表面积大有利于升华,厚度大不利于升华。一般分装厚度不大于10mm。有些产品需用大瓶。冻干较大量的产品时,可以采用旋冻的方法冻成壳状,或倾斜容器冻成斜面,以增大表面积,减小厚度。

产品的预冻方法有冻干箱内预冻法和箱外预冻法。箱内预冻法是直接把产品放置在冻干机冻干箱内的多层搁板上,由冻干机的冷冻机来进行冷冻。大量的小瓶和安瓿瓶进行冻干时为了进箱和出箱方便,一般把小瓶或安瓿瓶分装在若干金属盘内,再装进箱子。为了改进热传递,有些金属盘制成可分离式,进箱时把底抽走,让小瓶直接与冻干箱的金属板接触;对于不可抽底的盘子要求盘底平整,以获得产品的均一性。采用旋冻法的大血浆瓶要事先冻好后加上导热用的金属架或块后再进行冷冻。箱外预冻法有两种方法。有些小型冻干机没有进行预冻产品的装置。只能利用低温冰箱或酒精加干冰来进行预冻。另一种是专用的旋冻器,它可把大瓶的产品边旋转边冷冻成壳状结构。然后再进入冻干箱内。

还有一种特殊的离心式预冻法,离心式冻干机就采用此法。利用在真空下液体迅速蒸发,吸收本身的热量而冻结。旋转的离心力防止产品中的气体溢出,使产品能“平静地”冻结成一定的形状。

(二)产品的初段干燥

产品在升华时要吸收热量,升华阶段必须对产品进行加热,但对产品的加热量是有限度的,不能使产品的温度超过其自身共熔点温度。升华的产品如果低于共熔点温度过多,则升华的速率降低,升华阶段的时间会延长;如果高于共熔点温度,则产品会发生熔化,干燥后的产品将发生体积缩小、出现气泡、颜色加深、溶解困难等现象。因此升华阶段产品的温度要求接近共熔点温度,但又不能超过共熔点温度。

可以利用气压测量法来确定升华时产品的温度,把冻干箱和冷凝器之间的阀门迅速地关闭1~2s的时间。然后又迅速打开,在关闭的瞬间观察冻干箱内的压强升高情况,记录压强升高到某一点的最高数值。从冰的不同温度的饱和蒸气压曲线或表上可以查出相应数值,这个温度值就是升华时产品的温度。

冷冻干燥时冻干箱内的压强,过去认为是越低越好,现在则认为不是越低越好,而是要控制在一定的范围之内。冻干箱的合适压强一般认为是在10~30Pa,在这个压强范围内,既利于热量的传递又利于升华的进行。超过30Pa时,产品可能熔化,此时应发出真空报警信号,切断对产品的加热,甚至启动冷冻机对冻干箱进行降温,以保护产品不致发生熔化。因此为了冷冻干燥出好的产品,需要保持系统内良好而稳定的真空度。需要冷凝器始终处于低于-40℃以下的低温,因为-40℃时冰的蒸气压为10Pa左右。

升华阶段时间的长短与下列因素有关:①产品的品种,一般来说,共熔点温度较高的产品容易干燥,升华的时间短些。②产品的分装厚度,分装厚度大,升华时间也长。③升华时提供的热量,若提供的热量不足,升华速率减慢,升华时间延长。也不能过多地提供。④冻干机本身的性能,这包括冻干机的真空性能,冷凝器的温度和效能,甚至机器构造的几何形状等,性能良好的冻干机使升华阶段的时间较短些。

在产品的第一阶段时,除了要保持冻结产品的温度不能超过共熔点以外,还要保持已干燥的产品温度不能超过崩解温度。某些已干燥的产品当温度达到某一数值时会失去刚性,发生类似崩溃的现象,失去了疏松多孔的性质,使干燥产品有些发黏,相对密度增加,颜色加深。发生这种变化的温度就叫做崩解温度。崩解温度与产品的种类和性质有关,因此应该合理地选择产品的保护剂,使崩解温度尽可能高一些。

(三)产品的次级干燥

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在初级冻干完成后,所有的冰即被升华。但是结合水仍旧存在于产品中,在次级干燥时,最后相的干燥,牢固键合于固体样品的水,被称为吸收水转变成蒸气。这一过程被称为解吸作用。解吸是一个缓慢的过程,因为吸收水比液体水在同一温度下气压更低。冷冻干燥在样品和收集器的蒸气压力相等时彻底完成。如果样品在未完全干燥时过早地脱离系统,它也许会很快的降解和失去结构及生物性能。

在解吸阶段,可以使产品的温度迅速地上升到该产品的最高允许温度,并在该温度一直维持到冻干结束为止。迅速提高产品温度有利于降低产品残余水分含量和缩短解吸干燥的时间。产品的允许温度视产品的品种而定,一般为25~40℃。

在解吸干燥阶段由于产品内逸X分的减少,冷凝器温度的下降又引起系统内水蒸气压力的下降,这样往往使冻干箱的总压力下降到低于10Pa,这就使冻干箱内对流的热传递几乎消失。因此,即使板层的温度已加热到产品的最高允许温度,但由于传热不良,产品温度上升很缓慢。为了改进冻干箱传热,使产品温度较快地达到最高允许温度,以缩短解吸干燥阶段时间。要对冻干箱内的压强进行控制,控制的压强范围在15~30Pa。一般使用校正漏孔法对冻干箱内的压强进行控制。压强的控制也可采用间歇开关冻干箱和冷凝器之间阀门的方法、真空泵间歇运转的方法以及冷凝器冷冻机间歇运转的方法等。

一旦产品温度达到许可温度之后,为了进一步降低产品内的残余水分含量,高真空的恢复是十分必要的。这时上述控制压强的方法应停止使用。与冻干箱恢复高真空的同时,冷凝器由于负荷减少温度下降也达到了最低的极限温度。这样使冻干箱和冷凝器之间水蒸气压力差达到了最大值。这样的状况非常有利于产品内残余水分的逸出,一般此状况应不小于2h的时间,时间越长产品内残余水分的含量越低。

解吸阶段的时间长短取决于下列因素:产品的品种,产品不同,干燥的难易不同,最高许可温度较高的产品,时间可相应短些;残余水分的含量,残余水分的含量要求低的产品,干燥时间较长,产品的残余水分的含量应有利于该产品的长期存放,太高太低均不好,应根据试验来确定;冻干机的性能,在解吸阶段后期能达到的真空度高,冷凝器的温度低的冻干机,其解吸干燥的时间可短些。如果采用压强控制法,则改进了传热,使产品达到最高许可温度的时间缩短,解吸干燥的时间也缩短。

最后,冻干是否可以结束是这样来确定:产品温度已达到最高许可温度,并在这个温度保持2h以上的时间;关闭冻干箱和冷凝器之间的阀门,注意观察冻干箱的压力升高情况(这时关闭的时间应长些,30~60s)。如果冻干箱内的压力没有明显的升高,则说明干燥已基本完成,可以结束冻干。如果压力有明显升高,则说明还有水分逸出,要延长时间继续进行干燥。直到关闭冻干箱冷凝器之间的阀门之后无明显上升为止。

 

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