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王大虎:凝胶的类型及性质

用于分子筛色谱的基质必须具备以下性质:

①必须是化学惰性的。基质颗粒本身和待分离物质之间不能发生化学反应。

②基质应具有稳定的化学性质。可在很大pH和温度范围使用,且在长期反复使用中保持化学稳定性。

③不带或只带有很少量的电荷,防止与蛋白质之间发生静电吸附。

能够符合这些性质起到分子筛作用的物质有很多,常见的包括琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、浮石、琼脂、葡聚糖凝胶等,以葡聚糖凝胶应用最广。常见胶的种类和性能见表6-1。

表6-1 胶的种类和性能

 

续表

 

王大虎 (1)交联葡聚糖凝胶(Sephadex)

①Sephadex G:交联葡聚糖的商品名为Sephadex,不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示,G后面的阿拉伯数为凝胶吸水值的10倍。例如,G-25为每克凝胶X时吸水2.5g,而G-200为每克干凝胶X时吸水20g。交联葡聚糖凝胶的种类有G-10、G-15、G-25、G-50、G-75、G-100、G-150和G-200。因此,“G”反映了凝胶的交联程度、X程度及分布范围。

②Sephadex LH-20:Sephadex G-25的羧丙基衍生物,能溶于水及亲脂溶剂,用于分离不溶于水的物质。

(2)琼脂糖凝胶 琼脂糖凝胶的商品名很多,常见的有Sepharose(瑞典,pharmacia公司),Bio-Gel-A(美国,Bio-Rad公司)等。琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构,网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。一般情况下,它的结构是稳定的,可以在许多条件下使用(如水,pH4~9的盐溶液)。琼脂糖凝胶在40℃以上开始融化,也不能高压消毒,可用化学灭菌活处理。

(3)聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成凝胶,是以丙烯酰胺为单位,由Bis交联成的,经干燥粉碎或加工成形制成粒状,控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。交联剂越多,孔隙越小。聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶-P(Bio-Gel P),由美国Bio-Rad公司生产,型号很多,从P-2~P-300共10种,P后面的数字再乘1000相当于该凝胶的排阻限度。

(4)聚苯乙烯凝胶 商品为Styrogel,具有大网孔结构,可用于分离相对分子质量1600~40000000的生物大分子,适用于有机多聚物相对分子质量测定和脂溶性天然物的分级,凝胶机械强度好,洗脱剂可用甲基亚砜。

 

 

王大虎 五、基本操作

 

(一)凝胶的选择与预处理

1.凝胶的选择

选择凝胶种类的依据是凝胶的性质、分离目的和层析物质分子质量的大小。依据分离目的不同可以将其分为:

①如果分离目的是将样品中的大分子物质和小分子物质分开,由于它们在分配系数上有显著差异,这种分离称组别分离,一般可选用Sephadex G-25;对于小肽和低分子质量的物质的脱盐可使用Sephadex G-10或G-15。

②如果分离目的是将样品中一些分子质量比较近似的物质进行分离,这种分离又称分级分离。一般选用排阻限度略大于样品中最高分子质量物质的凝胶,层析过程中这些物质都能不同程度地深入到凝胶内部,最后得到分离。

2.凝胶的预处理

凝胶多以干粉形式保存,使用前需用水或洗脱缓冲液充分溶胀。在室温下让其充分溶胀达到平衡,通常需要较长时间,一般要两天。较快的做法是将干胶往水里加,边加边搅,以防凝胶结块,然后放到沸水浴中接近100℃加热,几个小时就可以使其溶胀,还可起到除去颗粒内部气泡和杀菌作用。但溶胀过程中注意不要过分搅拌,以防颗粒破碎,并且凝胶要始终保持X。待溶胀平衡后用倾泻法除去不易沉下的细小颗粒,最后凝胶经减压抽气除去气泡,即可准备装柱。

王大虎 (二)凝胶柱的制备

1.凝胶柱的选择

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分子筛色谱的分辨率取决于柱高。层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。纯化蛋白质时,柱床体积应为样品体积的25~100倍。除盐、游离荧光素时约为样品体积的4~10倍。柱太短,影响分离效果。柱长一些,分离效果好,但柱太长,则延长分离时间,样品也稀释过度。层析柱的内径也要选择适当。内径过细,会发生“器壁效应”,即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果。所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。对于除盐来说应为1∶5~1∶25;对于纯化蛋白质来说应为1∶20~1∶100。

连接柱的管子应该尽可能细和短,以避免区域扩散。柱必须可以承担分离时的操作压。流量适配器的使用可以调节不同的装柱体积,而且还可以减小死体积。

当用有机流动相、高盐或者变性剂操作时,对凝胶的要求十分严格。在使用凝胶时要按照生产厂家的说明使用。由于HPLC效率十分高,所以HPLC的凝胶柱比普通色谱柱短。虽然增加凝胶柱的长度可以得到较好的分离效果,但是,一般采用色谱柱串联的方法得到更好的结果。

2.装柱

分子筛色谱装柱的要求特别高,装柱好坏直接影响分离的效果。柱子要求均匀、连续无断层、无气泡。将色谱柱垂直装好,关闭出口,在柱内先装入约1/3高度的水或缓冲液。装柱前需将凝胶上面过多的溶液倾出,然后将溶胀好的凝胶在搅拌成稀浆的情况下用玻璃棒引流,连续缓慢地倒入柱内,使其自然沉降,待凝胶沉降至柱高的1/4~1/3时,打开柱的出口,使凝胶继续沉积至需要的高度。如果条件允许,与柱配套的装柱池可以方便装柱。虽然装柱可以在重力作用下完成,但是更有效的方法是使用泵将缓冲液泵入柱中。装柱时的流速大概应该比操作流速高50%。装柱完成时在凝胶上面有明显的缓冲液分层,然后停止供液,将柱顶端剩余的缓冲液流出,最后在凝胶上方大约剩余2cm缓冲液。

柱装得不好往往造成洗脱区带加宽,甚至使一些本来可以分开的区带重叠。装柱时的操作压力太大,会使凝胶床压得太实,降低流速。

3.凝胶柱的鉴定

检验凝胶柱是否均匀,一般采用带有颜色的蓝色葡聚糖2000或红色葡聚糖溶液,将其过柱,观察色带是否均匀下降。如果色带狭窄、平整、均匀下降,说明凝胶均匀,能够使用,否则表明胶柱不均匀,断裂或有气泡,需重新制备。也可对光用X观察,应均匀、无纹路、无气泡。

(三)平衡、上样与洗脱

1.缓冲液的选择

分子筛色谱不像其他色谱分离方式依赖于溶剂强度和选择性的改变来进行分离,在分子筛色谱中流动相只是起运载工具的作用,一般不依赖于流动相性质和组成的改变来提高分辨率。改变洗脱液的主要目的是为了消除组分与固定相的吸附等相互作用,所以和其他色谱方法相比,凝胶过滤洗脱液的选择不那么严格。洗脱液的选择主要取决于蛋白质的最适pH、溶剂组成、蛋白质抑制情况等,从而可以保持待分离目标分子的结构和功能。一般来说只要能溶解被洗脱物质,并不使其变性的缓冲液都可以用于凝胶过滤。

需注意的是,许多凝胶仍然残留剩余电荷。为了防止凝胶可能有吸附作用,一般洗脱液都含有一定浓度的盐,缓冲液的离子强度应该维持在0.15~2.0mol/L,以避免静电力或范德华力相互作用,从而得到理想的效果。如聚丙烯酰胺的交联可能降低凝胶的亲水性,导致一些低分子质量蛋白质和芳香族氨基酸残留,这些作用已经被用在某些情况下增强纯化效果,但是一般尽量避免这些作用影响分离效果。

2.上样

凝胶柱经过充分平衡后可进行上样,一般说来上样体积,分析用量为柱床容积的1%~4%;制备用量为柱床容积的20%~30%。这样可使样品的洗脱体积小于样品各组分之间的分离体积,获得较满意的分离效果。加样时应尽量减少样品的稀释及凝胶床面的搅动。样品与柱床体积比例悬殊时分离效果好,但过少的样品量不但会造成设备和器材的浪费,降低工作效率,还会造成样品稀释。

由于凝胶色谱的稀释作用,似乎样品浓度应尽可能大才好,浓度受蛋白质的溶解度和黏度限制,但样品浓度过大往往导致黏度增大,而使分辨率下降(图6-4)。一般要求样品黏度小于0.01Pa·s,这样才不至于对分离造成明显影响。对蛋白质类样品浓度以不大于4%为宜,一般控制在2~20mg/mL。

 

图6-4 样品黏度对洗脱曲线的影响

(1)加蓝色葡聚糖2000,使终质量分数为5%,相对黏度11.8

(2)加蓝色葡聚糖2000,使终质量分数为2.5%,相对黏度4.2

(3)加蓝色葡聚糖2000,使终浓度为1%

(资料来源:X,2002)

洗脱液应与X溶液一致,更换溶剂,凝胶体积会发生变化,影响分离效果。洗脱液要有一定的离子强度和pH,例如分离血清蛋白常用0.02~0.1mol/L,pH6.9~8.0的PBS(0.14mol/L NaCl)和0.1mol/L,pH8.0的Tris-HCl缓冲盐溶液(0.14mol/L NaCl)。

3.洗脱速度

洗脱速度也会影响凝胶过滤的分离效果(图6-5),一般洗脱速度要恒定而且合适。保持洗脱速度恒定通常有两种方法,一种是使用恒流泵,另一种是恒压重力洗脱。洗脱速度取决于很多因素,包括柱长、凝胶种类、颗粒大小等。洗脱速度慢一些,样品可以与凝胶基质充分平衡,分离效果好。但洗脱速度过慢会造成样品扩散加剧、区带变宽,反而会降低分辨率,而且实验时间会大大延长,所以实验中应根据实际情况来选择合适的洗脱速度,可以通过进行预备实验来选择洗脱速度。

 

图6-5 洗脱速度对洗脱曲线的影响

(资料来源:X,2002)

4.收集

利用自动分步收集器收集,检测器和分布收集器之间距离应该尽量短,以保证检测器可以尽可能快地分析分布收集器收集的组分。

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