大虎说事

王大虎:蛋白质的复性

 

将一些对人类有用的蛋白质的基因利用基因工程的方法在宿主菌种中表达,但是,往往其表达活性太强,而且蛋白质不能及时排出细胞,所以导致多余的蛋白质以包涵体的形式存在于细胞中。为了获得有活性的蛋白质,必须先对包涵体进行变性和复性。对包涵体进行复性,凝胶色谱法与稀释复性相比,有成本低、效率高、对目的蛋白质有初步纯化效果等优点。

例如,程鏖等人利用凝胶过滤层析法对RGD-葡激酶进行复性,具体步骤如下:15mL变性蛋白,蛋白质浓度5.6mol/mL,上样于经复性缓冲液平衡好的Sephacry1S-100柱[3cm(内径)×100cm(长度)],洗脱复性液0.05mol/L PBS(pH7.4)以1mL/min流速洗脱复性,图6-12所示为RGD-Sak过Sephacry1S-100柱复性的紫外检测图,峰1经测A260和A280比值认为是核酸峰,峰2为RGD-Sak目标蛋白峰,峰3为盐峰。取3个峰尖样品进行SDS-PAGE,结果RGD-Sak主要集中在目标峰。收集的目标蛋白峰蛋白定量有52.3mg蛋白质,复性后蛋白质得率62%。经后续离子交换柱纯化得完全活性的RGD-Sak 39mg,复性率46.4%。

 

图6-12 RGD-葡激酶经凝胶过滤柱(SephacrylS-100)复性的洗脱图谱

(资料来源:程鏖,2002)

 

 

第二节 离子交换色谱

 

一、基本原理

 

离子交换色谱(ion exchange chromatography, IEC)是利用离子交换剂上的可交换离子与周围介质中各种带电荷离子间的电荷作用力不同,经过交换平衡达到分离目的的一种柱层析法。

IEC所用的色谱填料离子交换剂是人工合成的多聚物,由基质、电荷基团和反离子三部分构成(图6-13)。基质一般采用的是纤维素或葡聚糖凝胶等物质,通过酯化、醚化或氧化等化学反应,引入阳性或阴性离子基团的特殊制剂,因而,可与带相反电荷的化学物质进行交换吸附。离子交换剂在水中呈不溶解状态,能释放出反离子,同时与溶液中的其他离子或离子化合物相互结合吸附,结合后不会改变离子交换剂本身和被结合离子或离子化合物的理化性质。

 

王大虎 图6-13 磺酸基纤维素离子交换剂组成示意图

根据离子交换剂上可电离基团(即反离子)所带电荷不同,可将离子交换剂分为阴离子交换剂和阳离子交换剂,反离子带电荷为正的(如Na+、H+)是阳离子交换剂,反离子带电荷为负的(如Cl-)是阴离子交换剂。含有欲被分离的离子的溶液通过离子交换柱时,各种离子即与离子交换剂上的荷电部位竞争性结合。任何离子通过柱时的移动速率决定于与离子交换剂的亲和力、电离程度和溶液中各种竞争性离子的性质和浓度。

离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物所进行的离子交换反应是可逆的。假定以RA代表阳离子交换剂,在溶液中解离出来的阳离子A+与溶液中的阳离子B+可发生可逆的交换反应,反应式如下:

 

该反应能以极快的速率达到平衡,平衡的移动遵循质量作用定律。

离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力,结合力的大小取决于离子交换剂的选择性。离子交换剂的选择性可用其反应的平衡常数K表示:

 

式中K——平衡常数;

[RB]——结合的B的浓度,mol/L;

[A+]——游离态A的浓度,mol/L;

[RA]——结合的A的浓度,mol/L;

[B+]——游离态B的浓度,mol/L。

如果反应溶液中[A+]等于[B+],则K=[RB]/[RA]。若K>1,即[RB]>[RA],表示离子交换剂对B+的结合力大于A+;若K=1,即[RB]=[RA],表示离子交换剂对A+和B+的结合力相同;若K<1,即[RB]<[RA],表示离子交换剂对B+的结合力小于A+。K值是反映离子交换剂对不同离子的结合力或选择性参数,故称K值为离子交换剂对A+和B+的选择系数。

阳离子交换剂对有机碱的选择性随着pKb的增大,亲和力增大,对两性化合物的选择性是随着等电点的增大,亲和力增大;阴离子交换剂对有机酸的选择性随着pKa的减小,亲和力增大,对两性化合物的来说,随着等电点的减小,亲和力增大。

溶液中的离子与交换剂上的离子进行交换,一般来说,电性越强越易交换。对于阳离子树脂,在常温常压的稀溶液中,交换量随交换离子的电价增大而增大,如Na+<Ca2+<Al3+<Si4+。若交换离子价数相同,交换量则随交换离子的原子序数的增加而增大,如Li+<Na+<K+<Pb+。

在稀溶液中,强碱性树脂的各负电性基团的离子结合力次序是:

 

弱碱性阴离子交换树脂对各负电性基团结合力的次序为:

 

两性物质如蛋白质、核苷酸、氨基酸等与离子交换剂的结合力,其等电点是离子交换层析进行的重要依据。在等电点处,分子的净电荷为零,与交换剂之间没有静电作用;当pH在其等电点以上时,分子带负电荷,可结合阴离子交换剂;当pH低于等电点时,分子带正电,可结合到阳离子交换剂。此外,在相同pH条件下,且等电点大于pH时,等电点越高,碱性越强,就越容易被阳离子交换剂吸附。因此通过溶液的pH对蛋白质的净电荷的影响可以达到分离纯化蛋白质的目的。

蛋白质分子与交换剂的结合是可逆的,用盐梯度或pH梯度可把吸附的蛋白质从柱上洗脱下来。其洗脱过程用图6-14简单表示如下。

 

图6-14 IEC原理示意图

1—平衡阶段:离子交换与反离子结合 2—吸附阶段:样品与反离子进行交换 3、4—用梯度缓冲液洗脱,先洗下弱吸附物质,而后洗下强吸附物质 5—再生阶段:用原始平衡缓冲液进行充分洗涤,即可重复使用

(资料来源:汪家政,2000)

 

 

王大虎 二、离子交换剂类型及性质

 

离子交换剂应具有高度的不溶性,保证在各种溶剂中不会发生溶解;具有稳定的理化性质,在使用过程中,离子交换剂不能因物理化学变化而发生分解;具有较多的交换基团;具有较大的表面积或疏松的孔状结构,确保交换离子X地发生扩散和交换。

(一)离子交换剂的类型

根据离子交换剂中基质的组成及性质,可将其分成两大类:疏水性离子交换剂和亲水性离子交换剂。

1.疏水性离子交换剂

此类交换剂的基质是一种与水亲和力较小的人工合成树脂,最常见的是由苯乙烯与交联剂二乙烯苯反应生成的聚合物,在此结构中再以共价键引入不同的电荷基团。由于引入电荷基团的性质不同,又可分为阳离子交换树脂、阴离子交换树脂及螯合离子交换树脂。

(1)阳离子交换剂 阳离子交换剂的电荷基团带负电,反离子带正电,故此类交换剂可与溶液中的阳离子或带正电荷化合物进行交换反应。依据电荷基团的强弱,又可将它分为强酸型、中强酸型及弱酸型三种,各含有表6-3可解离基团。

表6-3 疏水性阳离子交换剂的电荷基团

王大虎
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(2)阴离子交换剂 此类交换剂是在基质骨架上引入伯胺[—NH2]、仲胺[—NHCH3]、叔胺[—N(CH3)2]和季胺[—N+(CH3)3]基团后构成的,依据胺基碱性的强弱,可分为强碱性(含季胺基)、弱碱性(含叔胺、仲胺基)及中强碱性(既含强碱性基团又含弱碱性基团)三种阴离子交换剂。它们与溶液中的离子进行交换时,反应式为:

 

(3)螯合离子交换剂 这类离子交换树脂具有吸附(或络合)一些金属离子而排斥另一些离子的能力,可通过改变溶液的酸度提高其选择性。由于它的高选择性,只需用很短的树脂柱就可以把欲测的金属离子浓缩并洗脱下来。

 

疏水性离子交换剂由于含有大量的活性基团,交换容量大、流速快、机械强度大,主要用于分离无机离子、有机酸、核苷、核苷酸及氨基酸等小分子物质,也可用于从蛋白质溶液中除去表面活性剂(如SDS)、去垢剂(如曲拉通X—100)、尿素、两性电解质等。

王大虎 2.亲水性离子交换剂

亲水性离子交换剂中的基质为天然的或人工合成的化合物,与水亲和性较大,常用的有纤维素、交联葡聚糖及交联琼脂糖等。

(1)纤维素离子交换剂 纤维素离子交换剂或称离子交换纤维素,是以微晶纤维素为基质,再引入电荷基团构成的。根据引入电荷基团的性质,也可分强酸性、弱酸性、强碱性及弱碱性离子交换剂。纤维素离子交换剂中,最为广泛使用的是二乙胺基乙基(DEAE-)纤维素和羧甲基(CM-)纤维素。近年来Pharmacia公司用微晶纤维素经交联作用,制成了类似凝胶的珠状弱碱性离子交换剂(DEAE-Sephacel),结构与DEAE-纤维素相同,对蛋白质、核酸、激素及其他生物聚合物都有同等的分辨率。目前常用的纤维素交换剂如表6-4所示。离子交换纤维素适用于分离大分子多价电解质。它具有疏松的微结构,对生物高分子物质(如蛋白质和核酸分子)有较大的穿透性;表面积大,因而有较大的吸附容量。基质是亲水性的,避免了疏水性反应对蛋白质分离的干扰;电荷密度较低,与蛋白质分子结合不牢固,在温和洗脱条件下即可达到分离的目的,不会引起蛋白质的变性。但纤维素分子中只有一小部分羟基被取代,结合在其分子上的解离基团数量不多,故交换容量小,仅为交换树脂的1/10左右。

表6-4 离子交换纤维素

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(2)交联葡聚糖离子交换剂 交联葡聚糖离子交换剂是以交联葡聚糖G-25和G-50为基质,通过化学方法引入电荷基团而制成的。其中交换剂G-50型适用于相对分子质量为3×104~2×105的物质的分离,交换剂G-25型能交换相对分子质量较小(1×103~5×103)的蛋白质。交联葡聚糖离子交换剂的性质与葡聚糖凝胶很相似,在强酸和强碱中不稳定,在pH=7时可耐120℃的高热。它既有离子交换作用,又有分子筛性质,可根据分子大小对生物高分子物质进行分级分离,但不适用于分级分离相对分子质量超过2×105的蛋白质。

(3)琼脂糖离子交换剂 主要是以交联琼脂糖CL-6B(Sepharose CL-6B)为基质,引入电荷基团而构成。这种离子交换凝胶对pH及温度的变化均较稳定,可在pH3~10和0~70℃范围内使用,改变离子强度或pH时,床体积变化不大。例如,DEAE-Sepharose CL-6B为阴离子交换剂;CM-Sepharose CL-6B为阳离子交换剂。它们的外形呈珠状,网孔大,特别适用于相对分子质量大的蛋白质和核酸等化合物的分离,即使加快流速,也不影响分辨率。

(二)离子交换剂及缓冲液的选择

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