王大虎

王大虎:亲和吸附剂的再生和保存

王大虎

一般情况下,使用过的亲和层析柱,用大量的洗脱液或较高浓度的盐溶液洗涤,再用平衡液重新平衡即可再次使用。但在一些情况下,尤其是当待分离样品组分比较复杂的时候,亲和吸附剂可能会产生较严重的不可逆吸附,使亲和吸附剂的吸附效率明显下降。这时需要使用一些比较强烈的处理手段,使用高浓度的盐溶液、尿素、盐酸胍等变性剂或加入适当的非专一性蛋白酶。但如果配体是蛋白质等一些易于变性的物质,则应注意处理时不能改变配体的活性。

亲和吸附剂的保存一般是加入0.01%的叠氮化钠,4℃下保存。也可以加入0.5%的醋酸洗必泰或0.05%的苯甲酸。应注意不要使亲和吸附剂冰冻。

(三)基本操作

1.吸附

亲和层析吸附剂制备好后,装入色谱柱中,色谱柱无特殊要求,常用短而粗的柱子。根据纯化物质的量、吸附能力来选择。吸附能力强的常用短柱,吸附能力弱的常用长一些的柱子。

上样时应注意选择适当的条件,包括上样流速、缓冲液种类、pH、离子强度、温度等,以使待分离的物质能够充分结合在亲和吸附剂上。

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一般生物大分子和配体之间达到平衡的速度很慢,所以样品液的浓度不宜过高,上样时流速应比较慢,以保证样品和亲和吸附剂有充分的接触时间进行吸附。特别是当配体和待分离的生物大分子的亲和力比较小或样品浓度较高、杂质较多时,可以在上样后停止流动,让样品在层析柱中反应一段时间,或者将上样后流出液进行二次上样,以增加吸附量。样品缓冲液的选择也要使待分离的生物大分子与配体有较强的亲和力。另外样品缓冲液中一般有一定的离子强度,以减小基质、配体与样品其他组分之间的非特异性吸附。生物分子间的亲和力受温度影响,通常亲和力随温度的升高而下降。所以在上样时可以适当选择较低的温度,使待分离的物质与配体有较大的亲和力,能够充分的结合;而在后面的洗脱过程可以适当选择较高的温度,使待分离的物质与配体的亲和力下降,以便于将待分离的物质从配体上洗脱下来。

上样后用平衡洗脱液洗去未吸附在亲和吸附剂上的杂质。平衡缓冲液的流速可以快一些,但如果待分离物质与配体结合较弱,平衡缓冲液的流速还是较慢为宜。如果存在较强的非特异性吸附,可以适当用较高离子强度的平衡缓冲液进行洗涤,但应注意平衡缓冲液不应对分离物质与配体的结合有明显影响,以免将待分离物质同时洗下。

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2.洗脱

从柱中洗脱目标产物是亲和层析是否成功的关键。通常采用降低目标产物与配体之间的亲和力的方式进行洗脱。亲和层析的洗脱方法可以分为两种:特异性洗脱和非特异性洗脱。

(1)非特异性洗脱 通过改变洗脱缓冲液pH、离子强度、温度等条件(表6-9),降低待分离物质与配体的亲和力,从而将待分离物质洗脱下来。

表6-9 亲和层析的非特异洗脱条件

续表

可使蛋白质变性。

对于吸附得十分牢固的生物大分子,必须使用较强的酸或碱作为洗脱剂,或在洗脱液中加入破坏蛋白质的试剂,如脲、盐酸胍。这种洗脱方式往往造成不可逆的变化,导致纯化的对象失去生物学活性。因此,对于洗脱得到的蛋白质溶液应立即进行中和、稀释或透析。

(2)特异性洗脱 特异性洗脱是指利用洗脱液中的物质与待分离物质或与配体的亲和特性而将待分离物质从亲和吸附剂上洗脱下来。

特异性洗脱也可以分为两种:一种是选择与配体有较强亲和力的物质进行洗脱,另一种是选择与待分离物质有亲和力的物质进行洗脱。前者在洗脱时,洗脱液中的物质与配体亲和力较强从而取代待分离物质与配体的结合,原本与配体结合的待分离物质被洗脱下来。例如用凝集素作为配体分离糖蛋白时,可以用适当的单糖洗脱,单糖与糖蛋白竞争对凝集素的结合,可以将糖蛋白从凝集素上置换下来。第二种方法洗脱时,洗脱液中的物质与待分离物质有较强亲和力,这种物质与配体竞争对待分离物质的结合,在适当的条件下,待分离物质与这种物质结合而脱离配体,从而被洗脱下来。例如用染料作为配体分离脱氢酶时,可以选择NAD+进行洗脱,NAD+是脱氢酶的辅酶,它与脱氢酶的亲和力要强于染料,所以脱氢酶就会与NAD+结合而从配体上脱离。特异性洗脱方法的优点是特异性强,有较高的分辨率。但由于亲和吸附达到平衡比较慢,特异性洗脱往往需要较长的时间和较大的洗脱体积,可以通过适当的改变其他条件,如选择亲和力强的物质洗脱、加大洗脱液浓度等,来减少洗脱时间和洗脱体积。

(四)应用实例

刘宏等利用双环氧化合物1,4-丁二醇-2-缩水甘油醚为活化体及连接臂,在硼氢化钠(NaBH4)存在的碱性条件下,将载体Sepharose CL-4B与雷诺普利(lisinopril)共价连接在一起,成功合成亲和层析胶,并利用该亲和层析胶对猪肺血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme,ACE)进行分离提纯。

猪肺组织匀浆经116~216mol/LX铵分级沉淀、透析平衡、亲和柱分离等步骤,分离提纯ACE。其中层析条件为:样品以20mL/h流速上样亲和柱(110cm×8cm),依次用40mL 0.13mol/L NaCl,0.3%曲拉通X-100,20mmol/L Tris缓冲液,pH7.5和不含曲拉通的上述缓冲液洗柱,至指示器基线平稳后,用50mmol/L硼酸钠缓冲液,pH9.5,洗脱收集蛋白质峰,最后用0.12mol/L NaOH洗柱并收集蛋白质,检测各收集管酶活力。亲和层析图见图6-27。

 

图6-27 猪肺ACE的亲和层析图

蛋白质浓度 酶活力

(资料来源:刘宏,2000)

从200g猪肺中提纯得到0.79mg ACE蛋白,酶活力回收11.9%,比活力38.18U/mg。与层析前的酶液比较,亲和层析一步提纯可达264倍。

对提纯的ACE进行电泳鉴定,可见经亲和层析法分离提纯,一步就达到单一条带的电泳纯(图6-28),经与蛋白质分子质量标准对照后计算其分子质量约为180ku。

 

图6-28 ACE的SDS-PAGE鉴定

S—粗提液 A—纯化ACE M—蛋白质分子质量标准

(资料来源:刘宏,2000)

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