王大虎

王大虎:灌注色谱

王大虎

一、基本原理

灌注色谱(perfusion chromatography)是20世纪90年代发展起来的一种新的色谱技术,它特别之处是采用了具有贯穿孔的颗粒新介质,解决了传统液相色谱“停滞流动相传质”问题,打破了流速、分辨率与容量间三角互相制约的关系,即在流速增加的情况下,柱容量、分辨率均不会降低,且压力不会升高,从而使快速分离生物大分子成为可能。

灌注色谱综合了对流色谱和扩散色谱的优点,代表了一种解决液相色谱传质问题的先进方法。它能以比一般HPLC快10~100倍的速度在较短的循环时间内进行生物大分子的分离,同时不明显损失分离度和柱容量。这一新方法还可以通过介质表面的衍生化反应进行多种模式的色谱分离。

灌注色谱所采用的颗粒内部分布着两种结构的孔隙,一种是贯穿整个颗粒的特大孔,孔径为600~800nm,被称为穿透孔或贯穿孔;另一种是连接这些特大孔的较小一些的孔,孔径为50~150nm,孔深一般不超过1Lm(光通量单位),被称为连接孔或扩散孔。这种介质允许流动相流经其内表面,也即流动相灌注入介质颗粒中,被分离溶质会随流动相一起迅速接近介质的内孔表面,而不是靠浓度梯度进行扩散传质,因而能加快传质过程。同时,由于介质颗粒内部可利用反应的表面积大幅度增加,容量和分辨率也随之提高。因此,灌注色谱传质方式不同于传统液相色谱,如图6-62、图6-63以及表6-23所示。

图6-62 灌注色谱填料颗粒的示意图

1—穿透孔 2—扩散孔

(资料来源:熊博晖,1997)

图6-63 传统液相色谱和灌注色谱作用原理示意图

(资料来源:陈执中,2000)

表6-23 扩散与灌注的比较

折合板高h是间接评价分离介质性能的参数之一,它受多种因素影响,通常可表示为:

式中υ——通过柱床的流体折合流速,mL/min;

A——涡流扩散系数;

B——纵向扩散或轴向分子扩散系数;

C——停滞流动相传质阻力系数。

在高流速下,谱带展宽主要由C控制,此时式(6-11)可表示为:

式中µ——流动相的线速度,mL/min;

Deff——有效扩散系数;

dp——担体微粒的直径,µm;

c——系数。

公式(6-12)表明,对于一般HPLC,流速越快,折合板高就越大,分离度就越低。

对于灌注色谱,当流速增加到一定程度时,介质的穿透孔内对流速度会超过扩散速度,传质方式由扩散转变为灌注,随着流速的不断增大,产量也不断增加,但并未引起谱带展宽(即分离度降低)。这是因为灌注色谱的Deff可以近似认为由对流因素[upore(穿透孔中的流速)×dp]来决定。对于给定的色谱柱和流速,穿透孔中的流速与床内流速的比值为常数α=upore/u,因而,Deff=upore×dp=uαdp,h=cdp/α。

因此,在灌注色谱中,分离度与表面液体速度和增加流速无关而保持常数,如图6-64所示。同时也说明,灌注色谱法是一种快速高分离度制备分离生物大分子的方法。

图6-64 折合板高h与流速u的关系

(资料来源:熊博晖,1997)

王大虎

二、灌注色谱介质

王大虎
王大虎

目前所用的灌注色谱填料主要是POROS的系列,如图6-65所示,它是由美国Perseptive Biosystems公司开发、取名为POROS的系列灌注色谱。介质是由苯乙烯(ST)和二乙烯基苯(DVB)通过悬浮聚合、乳液聚合等方法制备的多孔型高分子微球。粒径规格为10Lm(H型)和20Lm(M型)两种。随着连接的官能团不同,又分为反相(R型)、强阴离子交换(Q型)和强阳离子交换(S型)等多种模式的介质类型。介质本身的孔隙率约50%,一般可耐压20MPa。

图6-65 液流通过POROS示意图

(资料来源:夏小燕,1994)

这种介质的一个突出特点是孔内“停滞流动相的传质阻力”大大减小。这是因为颗粒内的传质过程主要靠穿透孔内的对流传递,生物大分子溶质能随流动相的液流迅速达到孔内的活性表面。虽然在穿透孔之间还存在若干扩散孔,它们不能形成快速对流传质,但这种孔的深度一般不超过1Lm,扩散程很短,不会造成明显的传质阻力,而且扩散孔的存在恰恰提供了较大的表面积和柱容量。

从灌注色谱介质的材料方面得知:①苯乙烯-二乙烯基苯聚合物的化学性质和机械性能非常稳定,容易选择和合成,能够与碳氢化合物很快交联,制成各种色谱模式的填料。②交联聚合反应发生在基质的表面,且能与水共存应用,这样既减少了溶剂的平衡时间,又阻止了介质的缩水作用。③此类树脂本身具有十分大的孔截面,保证了流动相顺利通过吸附剂的颗粒。

三、应用

灌注色谱法可用于蛋白质、多肽、酶、低聚糖、生物碱、蒽醌、苷类等复杂混合物的分析和分离纯化。

1.从茶薪菇中分离金属硫蛋白

以BioCAD 700E灌注色谱系统为平台,采用POROS 20HQ色谱柱分离纯化Cd诱导的茶薪菇金属硫蛋白。最终在优化的选择系统条件下(浓度20mmol/L,pH8.2 Tris-HCl缓冲液,流速5mL/min,0.6~1.2mol/L NaCl梯度洗脱)对Cd诱导的茶薪菇金属硫蛋白进行分离纯化,得到很好的分离结果,色谱图如图6-66所示。

图6-66 灌注色谱法分离纯化茶薪菇Cd-MT的色谱图

1—254nm光吸收值曲线 2—280nm光吸收值曲线 3—NaCl浓度变化曲线,峰Ⅰ是Cd—MT蛋白质峰

(资料来源:刘安玲,2002)

王大虎

2.从绿豆中分离抗菌蛋白

以BioCAD 700E灌注色谱系统为平台,采用POROS 20HS色谱柱分离纯化绿豆中抗菌蛋白。绿豆抽提液首先经过CM-Sephadex柱,得到的活性峰组分经浓缩、透析脱盐后,进行POROS 20HS色谱柱HPLC进一步纯化所得到的5个洗脱峰中,其中nsLTP峰为纯化的抗菌蛋白-非特异脂转移蛋白(nsLTP),结果如图6-67所示。

图6-67 P1组分在POROS 20HS柱上的nsLTP峰

曲线表示OD280,直线表示洗脱梯度;色谱条件:色谱柱0.75cm(内径)×7.5cm(长度),流速:3mL/min,A液:0.02mol/L,pH6.0的PBS,B液:0.02mol/L,pH6.0的PBS含0.7mol/L NaCl;检测波长280nm

(资料来源:汪少芸,2004)

将收集的nsLTP峰的样品进行SDS-PAGE(分离胶15%)电泳分析,结果如图6-68所示,仅在14ku以下有单一的带,这说明已经得到电泳纯的蛋白质。

图6-68 nsLTP SDS-PAGE图

电泳条件:15%分离胶,恒压:120V,考马斯亮蓝染色

(资料来源:汪少芸,2004)

 

发表评论

电子邮件地址不会被公开。 必填项已用*标注