王大虎

王大虎:X液相色谱

X液相色谱(multi-dimensional liquid chromatography,MDLC)是将两个或更多类型的色谱柱串联使用,在柱之间利用切换阀将经过初次分离的全部或部分组分选择性地转入另一种或几种不同类型的色谱柱中进一步分离的一种分离方法。这项技术很好地解决了传统的HPLC受峰容量和分辨率的限制所带来的问题,能够实现对复杂样品的分析分离。MDLC有着以下的优点:提高色谱系统的分离能力和选择性,缩短分析时间;富集痕量组分,提高分析灵敏度;能从复杂的多种组分中排除干扰物质,有选择地针对感兴趣组分进行分析;能起到样品预处理的作用,分析柱受到的污染较少。

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一、基本原理

MDLC是将分离机理不同且相互独立的色谱柱串联起来构成的分离系统。样品经过第一维的色谱柱进入接口中,通过浓缩、捕集或切割后被切换进入另一维色谱柱及检测器中。由于每一维色谱柱分离原理不同,可根据样品的不同特性(包括分子质量大小、电荷、疏水性、特殊分子间亲和作用等)把复杂混合物分成单一组分,这样,即便有些组分在某一方面性质上相似而在一维分离系统中不能完全分离,但在其他系统中可能性质差异较大能够得到很好的分离。

MDLC的总分辨率,可以简单地估计为每个分离维各自分辨率平方加和的平方根。完全正交的X液相色谱,理论峰容量是每种一维分离模式单独运行时峰容量的乘积。假如两种分离系统都有100的峰容量,那么良好的二维系统理论上可产生10000的峰容量。而在实际操作中,X液相色谱的峰容量可以通过公式(6-13)估算:

式中nc——峰容量;

t——样品在色谱柱中洗脱时间,min;

4σ——分离峰的平均标准误差。

MDLC通过柱结合技术实现样品的柱间切换。柱切换通常可分为部分切换和整体切换两种模式。部分模式即采用中心切割技术,只将第一维中洗脱下来感兴趣的部分注入后续维色谱柱进行进一步的分离研究。这种模式不能获得样品的全部组分信息。整体模式即全X液相色谱,它是指将第一维中洗脱下来的全部组分进行后续维的分析,因此,这种模式能够获得样品的全部信息,适用于复杂X的研究。

根据对一维洗脱组分进行后续分离的连续性,还可以将MDLC分离分为离线操作和在线操作。离线操作是将前一根色谱柱分离的组分依次收集起来,再分别注入第二根色谱柱进行分离。在线操作是将第一维的洗脱组分直接切换注入后续柱上,使样品在第一维与最后一维的分离几乎同时进行、结束。相比离线操作,在线操作具有分辨率高、快速、易于实现自动化等优点。

基于不同的分离目的,可以采用不同分离机理的柱系统构建MDLC分离系统,目前大多数X液相色谱采用的是二维X,即二维液相色谱。体积排阻色谱(SEC)、反相(RP)色谱、亲和(AC)色谱、正相(NP)色谱、手性(Chiral)色谱、IEC、HIC等分离模式皆可以组合用于特殊目的的分离。对于两种分离模式的组合,不仅应考虑分离选择性、分辨率、峰容量、柱容量及洗脱速度等因素,对于生物样品,分离、回收率和活性等因素也可能非常重要。在实际X分离系统的构建过程中,必须综合考虑不同因素的影响,选择合理的分离模式和柱系统。表6-24列举了几种常见液相色谱的分离模式的比较。

表6-24 几种液相色谱分离模式的比较

将上述不同分离机制的色谱模式进行组合即可得到不同的二维X,如体积排阻色谱/反相色谱(SEC×RP)、离子交换色谱/反相色谱(IEC×RP)、疏水作用色谱/反相色谱(HIC×HP)、亲和色谱/反相色谱(AC×RP)、正相色谱/反相色谱(NP×RP)、反相色谱/手性色谱(RP×Chiral)。

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二、基本操作

(一)MDLC系统

MDLC系统主要由进样系统、分离系统、接口切换系统、分流及馏分收集系统、检测系统以及软件控制系统等六大部分组成,图6-69所示为以二维液相色谱为例的示意图。

图6-69 二维液相色谱组成示意图

(资料来源:张维冰,2007)

基于不同的分离模式组合以及切换技术,目前已经构建了多种二维液相色谱系统。图6-70所示为利用自动进样器实现切换构建的全自动简易二维液相色谱分离平台。

图6-70 全自动简易二维液相色谱分离平台

(资料来源:张维冰,2007)

(二)固定相、流动相的选择及柱温的影响

MDLC中,样品的选择性改变主要通过选择不同的固定相和流动相或其他的分离参数实现,如温度、pH等。设计一个二维分离X的关键是相X的选择,由于它影响二维分离X的正交性,因而影响控制峰数目的峰容量。此外,还应考虑两维中流动相是否互溶,缓冲盐能否析出,第一维流动相与第二维固定相是否兼容等因素的影响。

1.固定相的选择

分离柱固定相的选择对于成功的分离是十分重要的。以氧化硅、二氧化锆、氧化钛和氧化铝无机基质和以聚乙烯-二乙烯基苯、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯等有机基质的固定相填料在制备合成方面的迅速发展,给MDLC奠定了更广泛的基础。近年来,新出现的整体柱应用于MDLC的第二维分析分离中,它相对于填充柱具有渗透性强,柱压降低可在高流速下使用,柱平衡速度极快、柱效高等特点,使快速分离分析和制备成为可能。新型的通道限制性填料(restricted access media,RAM)具有离子交换、反相等不同的作用机制可用来进行X分离。此外,Venkatramani等在二维液相色谱中也使用了具有混合模式的固定相,即Primesep 2B和Primesep 2100,因为它们在一定条件下对于不同的分析物具有独特的选择性,因而在分辨共同洗脱组分时具有很大的潜力。

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2.流动相的选择

在某种程度上,分离的选择性可通过改变溶剂、pH得以改变。在MDLC中,从一维到二维转移的溶剂体积以两倍或更多倍的放大,超出进样体积,易产生黏性指迹。它是一种流动不稳现象,导致在两种不同黏性流体界面的扰动,从而对色谱的分离结果产生影响。在MDLCX,降低这种流体的干扰,优化分离效果,正确选择流动相是很重要的。pH对分离的选择性也有影响。在分离复杂混合物中,选择性是一个重要的因素,在每一维中可以使用不同的色谱模式。同时这些不同的流动相又是每个模式特有的,其中一些可能不完全兼容。

3.温度的作用

尽管在选择性方面柱温通常不如溶剂类型、pH、梯度洗脱斜率等变化影响大,然而它能成为这些参数的有力补偿变量。在许多HPLCX中,温度的变化比溶剂类型或pH的改变更加便利。温度对保留因子κ的贡献主要由方程所示,见公式(6-14)。

式中∆H——溶质在固定相和流动相两相间转移相联系的焓变,J/mol;

∆S——相应的熵变,J/(mol·K);

R——摩尔气体常数,J/(mol·k);

T——柱温,K;

β——柱的相比;

P——压力,Pa。

对小分子在反相X典型的焓变约为-15~-10kJ/mol,而大分子常具有更大的焓变。Bowermaster和McNair在研究中发现甲醇浓度增加1%与温度增加4℃对溶质保留的影响具有近乎同样的效应。相比于小分子或许多大分子,更多的蛋白质和多肽表现出不同的保留行为,由于在较高的温度下(25~50℃)蛋白质三维结构的变化使它的表面溶剂分子数发生变化,熵和焓也随之改变,从而导致了保留行为的变化。溶剂强度和温度的影响常是互补。特别是对较大的分子,如多肽和蛋白质,同时优化温度和洗脱梯度被认为是控制谱带扩展和保留行为的有效和便利的方式,常认为在熵占主导的分离中温度变化比溶剂变化更有利。

在高温下液相色谱的流动相黏性降低,因此对耐热的待分析物,可以考虑在较高温度范围内进行调节,这时待分析物的扩散增加,从而增加了传质,这常导致柱效的提高和柱后压的降低,允许使用更高的流速或使用具有更高板数的更长的色谱柱进行分离。当然温度对不同类型的物质(酸性、碱性或离子型化合物)、不同的流动相构成以及不同pH范围下的分离结果的影响是很复杂的。温度的增加会影响固定相的稳定性,如100℃以上,在水溶液流动相下,目前最常用的硅胶基C18固定相会随时间的增加而迅速降解。同样为了使用高温,分析物需要在色谱运行时保持热力学稳定。

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(三)二维液相柱色谱的切换方式

将一维分离的样品组分有效地转移到第二维柱系统中的过程在切换接口中完成,可根据需要使用不同的接口形式:使用捕集柱捕集一维洗脱产物、使用样品环储存一维洗脱产物、使用平行柱交替分析样品。在HPLC中,X柱色谱有时称为柱切换色谱。使用柱切换技术可以提高复杂样品分辨率;通过使用中心切换、反冲、前后切割和循环等方式还可以跟踪富集分析物,增加样品的生产量。在线柱切换过程,节省了大量的时间,可实现全自动化,便于更精准的操作,同时通过结合其他不同色谱模式提高选择性,具有保护感光分析物和有机溶剂消耗少等优点。另一方面,由于要求切换阀和额外的柱和泵系统,以及流动相兼容性的要求和预柱的周期替代等限制了MDLC技术的广泛应用。

不管是哪种接口形式,接口中选用的阀一般有4、6、8、10和12通道等。其中全二维液相色谱系统的接口切换阀通常由2个4通或2个6通、1个8通、1个10通、1个12通构成,1个6通多用于部分模式的二维系统中。

三、应用

MDLC具有快速、灵敏、高通量和易于实现自动化等特点,能够适用于复杂X的分析分离。近年来,它取代二维电泳在蛋白质组学的研究领域得到广泛应用。表6-25所示为MDLC在蛋白质组研究中的一些实例。

表6-25 二维液相色谱在蛋白质组研究中的应用举例

注:PC:峰容量;LIF:激光诱导荧光检测器;RI:差示折光检测器;UV:紫外检测;MS:质谱。

张维冰等在研究酶解猪血蛋白中活性肽段中对分别采用一维色谱柱和二维液相色谱进行了比较。图6-71(1)和(2)分别是酶解猪血蛋白中活性肽段在强阳离子交换(SCX)柱和反向色谱柱上的分离色谱图。可以看出由于分离机理的差异得到了不同的分离结果,其中反相色谱的分辨率远大于离子交换色谱,其出峰数量达到60个,峰容量295,但反相色谱分离模式中存在很多峰重叠在一起没有分开。

图6-71 生物活性肽段在一维色谱柱上的分离色谱图

(1)强阳离子交换色谱柱:Hypersil SCX,[100mm(长度)×2.1mm(内径),5µm];流动相:A:5mmol/LNaH2PO4-1%乙腈-水(pH4.0);B:A-1mol/L NH4Cl(pH4.0),流速:0.1mL/min;进样体积:5µL;检测波长:214nm

(2)反相色谱柱:Hypersil BDS C18[100mm(长度)×4.6mm(内径),5µm];流动相:A:0.1% HFP水;B:0.1% HFP乙腈,流速:1.0mL/min;进样:5µL;检测波长:214nm

(资料来源:张维冰,2006)

如图6-72是以SCX柱为一维色谱柱,RP柱为二维色谱柱,采用在线捕集接口形式,通过10通阀连接一、二维色谱柱,构建了二维液相色谱分离系统。将该系统用于酶解猪血蛋白中对ACE具有活性抑制作用的肽进行分离、鉴定,共检测出104个组分。

图6-72 X液相色谱分析

0mmol:0% B,100mmol:10% B,200mmol:20% B,500mmol:50% B,800mmol:80% B,1000mmol:100% B. 进样:20µL,检测波长:214nm,其他条件同图3

(资料来源:张维冰,2006)

由此可见,MDLC所提供的信息量远远大于常规液相色谱。

 

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