王大虎

王大虎:蛋白质的分析与检测

第一节 氨基酸序列分析

 

王大虎

一、基本原理

 

蛋白质和多肽是由20种氨基酸按照一定的顺序通过肽键连接成一长链,然后通过链内、链间的离子键、疏水作用等多种作用力进行折叠卷曲形成一定的构象并发挥其独特作用。氨基酸的排列顺序即蛋白质的一级结构决定了蛋白质的高级结构及功能。因此,分析蛋白质的氨基酸序列是进行蛋白质结构功能研究中不可缺少的部分。

进行氨基酸序列分析,至少采用两种方法分别裂解多肽(裂解位置不同),分别纯化并测定产物氨基酸序列,比较两套肽段序列,找出断裂点相重叠部分(接头部分),即可得到完整的氨基酸序列。对于一次不能连续测出序列的大肽段,需进一步裂解。若多肽链含有二硫键或其他配基,如酰氨基时,还需要分别确定它们在序列中的连接位置。

 

 

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二、氨基酸序列分析程序

 

(一)测序准备工作

在氨基酸序列分析前,必须做好样品的准备工作。内容包括:

(1)样品的纯度鉴定 采用多种互补有效的手段鉴定蛋白纯度,如SDS-PAGE、RP-HPLC、CE、IEC、亲和层析、肽(酶)谱分析等。

(2)脱盐 方法有RP-HPLC、凝胶过滤、透析、超滤、丙酮沉淀法等。

(3)巯基修饰 方法有丙烯酰胺修饰(包括还原、烷基化、脱盐),4-乙烯吡啶修饰(包括还原、烷基化、脱盐)等。

(4)蛋白质的分子质量测定 早期采用超离心分析和光散射法,目前常用方法有:SDS-PAGE法、凝胶过滤法、CE和质谱等。

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(5)构成蛋白质的多肽链的数目和大小 多肽链的数目通常可以从测定每分子蛋白质所含的N末端残基数,结合SDS凝胶电泳推导出来。若肽链之间非共价交联,可用高浓度变性剂(如8mol/L尿素)或解聚剂(如SDS)拆离,将各种链分离纯化,然后分别测定各链的一级结构。若肽链是由二硫键共价交联,就得选用适当的化学反应断裂二硫键,并将断裂后出现的巯基保护起来,然后将各种链分离纯化,再进行各个肽链的一级结构测定。拆开二硫键的方法有过甲酸氧化法、还原-羧甲基化法等。

(6)蛋白质的氨基酸组成 根据分子质量和氨基酸组成,可计算其中各种氨基酸残基数目,以指导裂解蛋白质方法的选择。

(7)蛋白质的端基分析 端基分析有助于判断蛋白纯度,后续分析中识别N末端和C末端,有助于肽段拼接,也可以判断N末端是否封闭或酰胺化等。

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(二)蛋白质的水解

(1)盐酸水解法 此法应用普遍,能较满意地得到Trp和Cys以外的其他所有氨基酸,而且较为简便。具体方法如下。

使用5.7mol/LHCl,真空状况下于110℃水解24~72h,在150℃下快速水解90min。Woodword等人用微波辐射法(150℃,20~25min)来水解蛋白质。通常情况下,水解后大部分氨基酸可定量回收,但Trp基本全被破坏,需借助其他方法。Ser、Thr分解缓慢,要准确测定,需要做几个水解时间实验,然后测定氨基酸含量,再推算分解时间为零时的氨基酸含量。含Val、Ile的肽链,因支链空间障碍而水解缓慢,故定量测定比较耗时。Cys可被部分破坏和氧化,宜在氧化成稳定的磺基丙氨酸后测定。Gln和Asn在酸水解中脱酰胺后变成Glu和Asp,测定水解释放出的氨量以计算Asn和Gln的总量,或者用不水解酰胺的方法水解肽键后直接测定。HCl水解时,Met易被氧化转变为甲硫氨酸砜,损失约20%,可以用这一数值进行校正,也可用保护剂(在盐酸中加入0.1%~1.0%巯基乙醇)来减少水解中Met的损失。HCl水解中Tyr的破坏率约为10%,若水解时加入0.1%~1.0%巯基乙酸和0.05%~0.1%苯酚,能明显提高Tyr、Ser回收率,同时Met也能免遭破坏。

(2)磺酸水解法 磺酸是非氧化性强酸,用4mol/L甲基磺酸,含0.2%β-吲哚基乙胺(色胺)进行水解,可使Trp的回收率达到90%以上,Ser和Thr的回收率接近定量值。其中Cys可用DTT还原水解液中的胱氨酸及其衍生物,然后用过量的连四X钠氧化,得到S-磺基半胱氨酸而加以测定。

(三)氨基酸的分离和定量测定

以IEC法分离氨基酸可分为柱后反应法和柱前衍生法两大类。前者是将游离氨基酸经过色谱柱分离后,再与显色剂(如茚三酮、荧光胺、邻苯二甲醛)反应。此法对样品预处理要求低,比较稳定,容易操作,缺点是灵敏度不高,操作时间长;后者是氨基酸先与化学偶联试剂作用,形成氨基酸衍生物,再经过色谱柱分离,直接检测衍生物。此法可检测OPA-、PTC-、PTH-、DABS-、Dansyl-和DABTH-氨基酸,灵敏度高,可利用HPLC分析,缺点是衍生物的不稳定性会干扰检测。

(1)茚三酮法 IEC后,氨基酸与茚三酮反应形成紫色产物,见图9-1,可于570nm比色测定,摩尔消光系数2×104。而蛋白质与茚三酮形成的黄色产物,于440nm比色测定,摩尔消光系数3×103。测定样品前,先用已知浓度的标准氨基酸的混合物做一次色谱分析,根据标准氨基酸的峰位、面积等参数来推算样品中的氨基酸。17种标准氨基酸混合液在氨基酸自动分析仪上的分析图谱如图9-2所示。

 

图9-1 茚三酮法原理图

 

图9-2 17种标准氨基酸混合液在氨基酸自动分析仪上的分析图谱

出峰顺序(从左到右):Asp、Thr、Ser、Glu、Pro、Gly、Ala、Cys、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、Lys、NH3、His、Arg

(资料来源:陶慰孙,1995)

(2)荧光胺法 室温下迅速和一级胺反应,产物的激发波长390nm,荧光波长475nm,反应如图9-3所示。

 

图9-3 荧光胺法定量测定氨基酸原理图

(3)OPA法 在巯基乙醇存在下,OPA能与一级胺作用生成具有强荧光的异吲哚衍生物,激发波长340~360nm,荧光波长455nm。

(4)苯氨基硫甲酰衍生物分析法 碱性条件下,异硫氰酸苯酯(PITC)与氨基酸反应形成苯氨基硫甲酰衍生物,在254nm检出。

(四)特殊氨基酸的测定

1.Trp的测定

由于Trp在酸水解后几乎全部破坏,需通过其他方法如碱水解(5mol/LNaOH)来测定。另外介绍以下两种方法:

(1)紫外吸收法 Trp和Tyr在280nm和290nm的紫外区有光吸收,可用完整的蛋白质进行Trp测定。先将蛋白质样品溶于6mol/L盐酸胍溶液中,然后分别在280nm和288nm测量蛋白质溶液的光吸收。Trp在288nm和280nm的摩尔消光系数分别是4815和5690;Tyr在288nm和280nm的摩尔消光系数分别是385和1280。根据比尔定律,可得如下式子:

 

在测得Tyr残基数的基础上,根据上式求Trp的残基数。

(2)对-二甲基氨基苯甲醛法 Trp在强酸条件下与醛反应生成带色产物。颜色的深浅与Trp的量成线性关系。该带色物质的最大吸收峰位于590nm,该法运用广泛,结果可靠。

2.巯基测定

主要方法有形成硫醇盐法、烷基化法和比色法,根据试剂与巯基反应后生成带色产物来进行测定的。

(1)5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)测定法 DTNB也称Ellman试剂,易溶于水,在巯基化合物的存在下,无色的DTNB将被转变成黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸,在412nm处具有最大吸收,DTNB的吸收光谱并不干扰巯基的测定。

(2)萘醌测定法 萘醌与巯基有当量加成关系,加成物在420nm左右有吸收峰,标准物和未知物在相同条件下测定,光密度增值与巯基浓度的关系在一定浓度范围内符合比尔定律。

3.二硫键的测定

(1)Ellman试剂法 当有一游离巯基存在时,Ellman试剂可与二硫键发生反应。虽然释放出的ES-(CNT)数与巯基数相等,但二硫键已被ES-裂解,形成DTNB(用ESSE表示)的衍生物(Ⓟ-S-S-E),反应式如图9-4所示。

 

图9-4 Ellman试剂法测定二硫键的原理图

在pH10.5碱处理与DTNB反应的蛋白质,则又从Ⓟ-S-S-E中释放出所有的CNT,这时发生碱催化的β-消除反应(如图9-5)。

 

图9-5 碱催化的β-消除反应

实际测定是先制成2mol/L硫氰酸胍、3mmol/L EDTA的蛋白质溶液并按前边提到的巯基测定法测定释放出的CNT量。然后再将这个溶液的pH调到10.5,再测定CNT量。二硫键的数目可按下式计算:

 

若蛋白质没有活泼巯基,可加入含巯基化合物,如Cys、谷胱甘肽和DTT,以启动此反应。

(2)2-硝基-5-硫代苯磺酸法 过量亚X钠与蛋白质反应可裂解蛋白质中的二硫键,如下式所示。

 

由于DTNB也与亚X盐作用,因此不能用来测定由亚X盐产生的蛋白质巯基的浓度,然而,2-硝基-5-硫代苯磺酸可用于测定这种情况下的巯基,因为它不与过量的亚X盐反应,但能与亚X盐释放的巯基作用,反应如下式所示:

 

实际测定时,含二硫键的蛋白质与2-硝基-5-硫代苯磺酸在暗处反应后,于412nm测定光吸收,用CNT的消光系数1.14×104L/(mol·cm)计算巯基数,此巯基数就是蛋白质中二硫键的数目。

 

 

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