王大虎

王大虎:肽链的专一性水解和肽片段的纯化

王大虎

(一)肽链的专一性水解

最普遍有效的Edman降解法测肽链序列,一次只能连续降解数十个残基,故需将多肽先裂解成较小的肽段,分别测定。裂解时要求裂解点少,专一性强,收率高。方法基本分两大类:化X和酶法。

1.蛋白质的化学裂解

化X裂解的肽段一般较大,适于在自动序列分析仪中测定序列,同时有利于肽段的吻合,所以化X对较大分子质量的蛋白质的序列测定是很重要的。

(1)CNBr裂解 CNBr能专一裂解Met残基的C末端肽键,产率达85%。CNBr与蛋白质中Met侧链硫醚基反应,生成溴化亚氨内酯,此产物与水进一步反应,将肽键断裂,反应如图9-11所示。

 

图9-11 CNBr裂解法

反应在酸性介质中进行,此时巯基也能发生反应,但不切断肽链。若事先用烷基化试剂保护巯基,可防止此反应发生。蛋白质一般含Met较少,所以CNBr裂解蛋白质能得到大的肽段。而Met如被氧化成砜或亚砜,则不能发生裂解反应,所以整个反应要在氮气容器中进行。CNBr相对Met要过量50100倍(摩尔比),反应时间通常为24h。

CNBr对Met-Ser、Met-Thr键的裂解率不高,因为它们进攻亚氨内酯中间物,Met变成高丝氨酸残基,而未裂解肽键(图9-12),当CNBr∶Met达500∶1时,可克服干扰作用。

 

图9-12 裂解Met-Ser或Met-Thr时,由于羟基进攻亚氨内酯引起的干扰作用

CNBr裂解采用的酸性条件,可引起蛋白质中其他肽键的裂解,特别是Asp-Pro键。如果某一序列含有这个键,则所得肽段数目要比根据Met量所预计的数目多。

(2)BNPS-Skatole法 BNPS-Skatole是一种温和的氧化剂和溴化剂,Trp裂解产率通常在40%~70%,蛋白质中含Trp很少。其结构如图9-13所示。

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图9-13 Trp结构图

BNPS-Skatole试剂不太稳定,对光敏感,所以反应要在暗处进行,试剂在Trp残基的C末端一侧裂解肽键,如图9-14所示。该试剂对Lys、His也能作用而形成干扰。

 

图9-14 BNPS-Skatole裂解Trp-X肽键的反应过程

(3)X-Cys键的裂解 有两种试剂可用于裂解含Cys残基的肽:2-硝基-5-硫氰苯甲酸(NTCB)和(2-甲基)-N-1-苯磺酰-N-4-(溴乙酰)醌二亚酰胺(也称Cyssor,因为专一性剪切半胱氨酸而得名)。这两种试剂都是在半胱氨酸的N末端侧发生裂解。反应机理如图9-15所示,裂解产率大于90%。

 

图9-15 试剂NTCB(1)和Cyssor(2)对X-Cys肽键的裂解机理

(4)羟胺裂解 NH2OH在pH9.0下能裂解Asn-Gly间的肽键,此法专一性不是很好,Asn-Leu和Asn-Ala键也能部分断裂。由于各种蛋白质中Asn-Gly出现几率很低,故此法所得到的肽段很大。其反应机理是,通过羟胺作用形成一个琥珀酰亚胺环状物,最后导致Asn-Gly键的裂解,反应过程如图9-16所示。

 

图9-16 Asn-Gly肽键的羟胺裂解

(5)Asp-Pro键的裂解 蛋白质中的Asp-Pro键对酸特别不稳定,在稀酸条件下,Asp-Pro键就能断裂。

2.蛋白质的酶法裂解

酶法裂解的优点是,专一性强,降解后的肽段容易纯化,产率较高,副反应少,在酸水解中容易受破坏的Gln、Asn和Trp等在酶解中都不受影响。用酶解法裂解肽键要考虑以下几种因素:pH、温度、蛋白质与酶的比例、反应时间、蛋白质物理状态等。裂解肽链的蛋白质水解酶见表9-2。

表9-2 肽链内切酶

 

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(二)肽段的分离纯化及纯度鉴定

1.肽段的分离纯化

根据肽段的物化特性分离,包括分子大小、电荷、极性、溶解度以及特殊的共价或非共价结合等性质。常用的方法有凝胶过滤法、离子交换法、薄层色谱法、薄层电泳、CE、HPLC等。

2.肽段的纯度鉴定

在肽混合物分离过程中常要鉴定个别分级物的纯度,以便确定是否需要进一步提纯。虽然在色谱和电泳中只有一条肽即表明是纯肽,但一般来说,鉴定肽是否足够纯只有一个标准:纯肽只有一种N末端。N末端有两种以上的,就要进一步提纯。

五、肽段的序列测定

 

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(一)手工序列测定技术

1.Edman化学降解法

降解所用试剂是PITC。降解过程包括三个主要反应,第一步为偶联反应。肽的α-氨基与PITC在碱性条件下发生偶联反应,产生异硫氰酸苯酯肽(简称PTC-肽)。第二步为断裂反应。在强酸作用下,PTC-肽的近N末端肽键断裂,产生2-苯胺基-5-噻唑啉酮衍生物(PTZ),与此同时形成一个少一个氨基酸残基的新肽,新肽的N末端仍是X的,可以进一步与PITC反应,进行第二次降解。第三步为转化反应。断裂产物PTZ不稳定,为便于随后的N末端氨基酸分析测定,要将这个不稳定化合物转化为3-苯基-2-乙内酰脲(PTH-氨基酸)。降解过程如图9-17所示。

 

图9-17 Edman化学降解图

A—偶联反应 B—裂解反应 C—转化反应

PTH-氨基酸非常稳定,可以薄层色谱、气相色谱、回水解法(即用酸水解PTH-氨基酸,使其转化为游离氨基酸,再用氨基酸分析仪测定)、HPLC等方法进行测定,即得氨基酸序列的第一个残基。

2.DNS-Edman序列分析法

这是对Edman降解技术的一种改良方法。此法结合了DNS技术的高灵敏性与Edman降解技术的连续性,如图9-18所示。

 

图9-18 DNS-Edman降解法测序过程

先取一小部分与DNS-Cl反应,按末端测定法测出该肽的第一个残基,然后用Edman降解剩余肽的第一个残基,经抽提、弃掉,同时得到少一个氨基酸残基的新肽。再取一部分新肽与DNS-Cl反应,酸水解后,得到一个具有强荧光的氨基酸衍生物,通过鉴定可知其第二个氨基酸残基。其余部分再进行Edman降解,降解后的新肽再取一小部分与DNS-Cl反应,经水解后鉴定DNS-氨基酸,则可知该肽链的第三个氨基酸残基,如此循环下去。

由于水解的生成物是带荧光的DNS-氨基酸,其检出的灵敏度比Edman法高几倍甚至十几倍,用样量少,又能连续进行。缺点是需用酸高温水解,致使Gln和Asn相应地变成Glu和Asp,而且不能检出色氨酸。

3.DABITC/PITC双偶合法

此法采用有色试剂4-N,N-二甲基氨基偶氮苯-4′-异硫氰酸酯(DABITC),它与肽的N末端结合,经酸裂解并转化后,N末端氨基酸从肽链上裂解下来,转换成有明显颜色的DABTH-氨基酸,在聚酰胺薄膜上色谱分离,经HCl蒸气熏即能显示红色斑点,而杂质与试剂反应显蓝色或紫色斑点。该法原理与Edman降解相同,如图9-19所示。

 

图9-19 DABITC/PITC双偶合法示意图

 

(资料来源:夏其昌,2004)

DABITC与氨基偶合反应产率20%~50%,将余下的未偶合的氨基再用PITC作第二次偶合,由于PITC与多肽的偶合反应近于定量,从而可定量的去除N末端,并暴露第二个氨基。暴露的N末端氨基又能与DABITC、PITC做双偶合降解,这样依次循环,逐个测定蛋白质或多肽的N末端氨基酸序列。

4.酶法降解测定肽序列

(1)氨肽酶法 氨肽酶是专一性从N末端逐个降解蛋白质或多肽的一类外肽酶,理论上只要能跟随酶水解进程,将释放的氨基酸分别定量测出,就能测出肽的序列。表9-3列出了各种氨肽酶及其专一性。

表9-3 各种氨肽酶及其专一性

 

(2)肽酶法 常用的羧肽酶有A、B、C三类。其中羧肽酶A最为常用。

(3)外肽二肽酶法 外肽二肽酶能每隔2个残基切断肽段。第一次将肽段用外肽二肽酶水解,得到一系列二肽,分离纯化并测出这些二肽的结构。第二次先将原来的肽段从N末端切去一个残基,再用外肽二肽酶水解,得到切口与第一次酶解的切口错开的一系列二肽,再分离纯化并测出这一批二肽的结构。结合两套二肽信息,就能得到被测肽的序列。

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(二)自动序列分析

蛋白质自动序列仪,基于Edman降解法,自动检测出残基性质与含量,最后自动报告出肽的氨基酸序列。有三种类型的序列仪:液相序列仪、固相序列仪、气相序列仪。

(1)液相序列仪 采用自旋式反应器,仪器的核心部分是一个反应杯,由一个马达带动,有调速控制。蛋白质或多肽样品经溶解后,通过一根导管注入反应杯中,离心力使其被均匀涂在杯壁上,形成一层薄膜,通过转速控制其厚度。反应试剂和溶剂通过导管进入反应杯,与薄层上蛋白质或肽的N末端进行Edman反应,降解下的ATZ-氨基酸衍生物通过另一导管收集,转换成PTH-氨基酸进行鉴定,如此循环分析。

液相序列仪不适于分析小肽,因为小肽在有机溶剂中溶解度大,易于从反应杯中洗出,而固相序列仪可以胜任。

(2)固相序列仪 先将肽段共价结合到一种惰性载体上,并装成柱,然后按一般的Edman降解程序从N末端逐级降解。由于肽结合在载体上,不会被溶剂洗掉,可增加循环次数,降解下来的氨基酸与剩余肽链容易分离。缺点是,肽链共价结合到载体上的收率较低,另外共价结合是通过氨基或羧基与载体结合,而多肽中Glu、Asp、Lys等除α-氨基和α-羧基外,还有其他侧链的氨基和羧基,也将结合到载体上,不能正确鉴定。

(3)气相序列仪 20世纪80年代初,有人利用弹筒型的玻璃反应室代替了液相序列仪中的旋转玻璃杯,用polybrene固定样品,Edman反应试剂(如三甲胺)以气体方式输送,其他以流动或液相脉冲方式输送。这种仪器的明显优点是:①灵敏度高,样品耗用最低在5×10-6mol水平;②试剂和溶剂消耗很低,大约是液相仪的1/10;③缩短了每步降解循环时间,提高了效率。

 

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