王大虎

王大虎:由肽段序列建立蛋白质的一级结构

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(一)重叠肽

肽链氨基酸残基全序列的确定,需要用两种或两种以上不同方法断裂多肽样品,得到两套以上肽段。不同方法产生的断裂点不同,切开彼此错位,两套肽段相互跨越切口而重叠,称为重叠肽。借助重叠肽可以确定肽段在原多肽链中的位置,如图9-20所示。

 

图9-20 重叠肽的作用示意图

第一套肽是由胰蛋白酶裂解原始肽而得到,第二套肽是胰凝乳蛋白酶裂解原始肽而得到,若把第一套肽看作重叠肽,那么由于重叠肽,可使第二套肽间的相互关系确定下来

(资料来源:陶慰孙,1995)

(二)二硫键位置的确定

若蛋白分子中存在链间或链内二硫键,在完成多肽链氨基酸序列分析后,需要对二硫键进行定位。一般直接用酶水解原来的含二硫键的蛋白质,可以选用胃蛋白酶,专一性较差,切点多,产生的肽段较小,而且胃蛋白酶作用pH在酸性范围,可防止二硫键发生交换反应。

酶解所得肽段混合物可以使用Brown及Hartlay的对角线电泳进行分离:将样品点在一张方形滤纸的中心点上,在pH6.5的条件下进行第一向电泳分离,肽段将根据大小、电荷不同分离开。然后将滤纸暴露在过甲酸蒸气中,使二硫键氧化断裂,产生2个含磺基丙氨酸的肽。再将滤纸旋转90°,在与第一向电泳同条件下进行第二向电泳。可发现除了含有二硫键的肽外,其余的肽均仍在滤纸的对角线的位置上。而含半胱氨磺酸的肽比原来小,且带了更多的负电荷,因而偏离了对角线。

肽斑以茚三酮显色,取下偏离对角线的肽斑(未用茚三酮显色的),分析其氨基酸顺序,与已确定的氨基酸顺序比较,即可确定二硫键的位置。

若分析中发现二硫键所在的肽链上还有另外的Cys时,即含有未参与二硫键形成的巯基,可在拆开二硫键之前将Cys的巯基用碘代乙酰胺封闭。二硫键不参与此反应,这样可以确定哪两个Cys参与二硫键。

(三)酰胺基位置的确定

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若在氨基酸分析中发现有酰胺基存在,则在一级结构研究中就要确定酰胺基的确切位置,目的是确定肽链中侧链羧基和C末端羧基是以—COOH形式存在,还是以—CONH2形式存在,也就是要确定是Glu、Asp还是Gln、Asn。不能确定时,常以Asx或Glx表示。确定酰胺基位置的方法有三种:

①当肽没有暴露于可使酰胺转化为游离酸的条件下时,有可能在Edman序列分析期间用TLC(薄层色谱)或GC(气相色谱)将苯异硫脲(PTH)化的酰胺与游离酸分开。

②含单一Asx或Glx的分离肽走电泳,常可指出其中是酰胺还是游离酸。如果Asx或Glx靠近N末端或C末端,使用适当的外肽酶可除掉不清楚的残基。比较外肽酶处理前后的电泳迁移率。则可区分Asn、Gln和Asp、Glu。若肽含多个Asx或Glx,则必须对肽进一步裂解、直至产生含单一Asx或Glx的肽,然后再用此法鉴别。

③用碳二亚胺-甘氨酸甲酯偶联法共价衍生游离羧基,如图9-21所示。用此法能产生游离羧基的放射性衍生物,因此,很容易与酰胺区分开,即使酰胺随后转变成游离酸也不影响鉴别。

 

图9-21 用碳二亚氨活化游离羧基,然后用反射性亲核物进行标记

(资料来源:陶慰孙,1995)

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(四)糖类、脂类和磷酸基位置的确定

共价衍生物通常连接在非常独特的氨基酸侧链上,糖类通过Asn或Ser连接。其通过氮原子相连,还是通过氧原子相连,可根据其酸不稳定性来区别。通过氧连接时对酸不稳定。脂肪酸通过Ser、Thr或Cys残基,以酯键与蛋白质相连。磷酸基通过Ser,有时通过Tyr、His与蛋白质相连。准确表征有关的残基,需要广泛降解并分离衍生的肽,直至得到含单一适当键的氨基酸留在肽中,然后根据推理进行装配。在有些情况下,这种共价取代与一级结构中的特殊序列有关,因此存在适当衍生的可能部位,如表9-4所示。

表9-4 共价取代的专一性序列

 

 

第二节 蛋白质免疫印迹

 

一、基本原理

 

蛋白质免疫印迹(Western blotting)是指电泳凝胶上的蛋白质带转移到固相载体(如硝酸纤维素薄膜)上,以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与第一抗体进行免疫反应,膜经漂洗后再与酶或同位素标记的第二抗体反应,通过底物显色或放射自显影等检测目的蛋白质的方法。该技术广泛应用于检测蛋白的表达水平。Western印迹与Southern印迹、Northern印迹类似,不同的是蛋白质免疫印迹采用PAGE,检测对象是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。

 

 

二、印迹过程

 

(一)主要器材

涉及有电泳相关器材、电转移装置、转印膜等。常用的转印膜有硝酸纤维素膜(NC膜)、PVDF(聚偏二氟乙烯)膜和尼龙膜。

NC膜主要以疏水键结合蛋白,不仅便宜,而且可简单快速地封闭非特异性抗体结合,一般先考虑用NC膜。

PVDF膜比NC膜疏水性强,与蛋白质结合更紧,可耐受更多的SDS。需要较严格的封闭条件,适用于蛋白质测序。

尼龙膜通过疏水键和静电相互作用结合蛋白,SDS耐受度高于PVDF,同样需要严格的封闭条件,适用于Northern、Southern印迹。

(二)试剂

1.TBS(Tris盐缓冲液)

100mmol/L Tris·HCl, pH7.5, 9g/L NaCl

2.转移缓冲液

4L水中加入18.2g Tris碱、86.5g甘氨酸;再加入1200mL甲醇,加水至6L。溶液pH8.3~8.4。如果用PVDF滤膜,甲醇浓度应降至15%;如果用尼龙膜,可不用甲醇。

也可用3-环己氨基-1-丙磺酸(CAPS)转移缓冲液:2.21g CAPS,0.5gDTT,150mL甲醇加水至1L,用NaOH调pH10.5,并冷却至49℃,针对分子质量大于60ku的蛋白质,应将甲醇浓度减少至1%。

3.封闭缓冲液

含3%BSA的TBS溶液;

含0.1%(体积分数)吐温20的TBS溶液(TTBS);

含5%脱脂乳粉的TBS溶液。

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(三)印迹步骤

1.蛋白质样品

经过一定程度的分离纯化得到蛋白质样品。

2.蛋白质电泳

通常是SDS-PAGE、制备电泳或双向电泳。

3.转印

有简单扩散和电转印两种。简单扩散是在电泳胶上依次平铺转印膜、滤纸、玻璃片和重物,借助重压和扩散将凝胶蛋白条带印迹到固相膜上。此法操作简单,可在一块胶上转印多张膜。电转印较简单扩散快速、可靠,又分湿转印和半干转印。

(1)湿转印 将整个夹心式转印X(从阴极至阳极顺序:支持垫、滤纸、凝胶、转印膜、滤纸、支持垫)垂直地浸入转印缓冲液中进行转印,如图9-22所示。

 

图9-22 湿转印示意图

(资料来源:马学军,2005)

电转步骤如下:

①以适量的转移缓冲液室温平衡凝胶,5min×3次。

②将转移盒浸没在转移缓冲液中,按照从阴极至阳极的“纤维支持垫-滤纸-凝胶-转印膜-滤纸-纤维支持垫”顺序放置,注意排除气泡。滤纸、转印膜需预先在转移缓冲液中浸泡过。

③将转移盒组装好,往转移槽中加入转移缓冲液,按正确的极性方向将转移盒放进电转仪中,连接电源。

④在冷却条件下从100V电转30~60min,或14V电转过夜。

⑤电转完毕,关闭电源,取出膜,做好标记。

(2)半干转印 先将转印X中的凝胶、膜、滤纸及支持垫浸泡在转移缓冲液中,X片刻后直接进行转印,而无需将其浸入缓冲液内,如图9-23所示。

 

图9-23 半干转印示意图

(资料来源:马学军,2005)

电转步骤如下:

①以转移缓冲液平衡电泳凝胶,5min×3次。

②将预先剪好与凝胶同大小的滤纸和NC膜在转移缓冲液中浸泡10min。

③组装转印夹层,从下至上依次为:Mylar聚酯薄膜屏蔽物(可选其他相当品)、3张滤纸、转印膜、凝胶、3张滤纸。每一步均排除气泡。

用半干转印法能有效地一次转移多片凝胶,只需在每叠独立的转移夹层间加一张预先用转移缓冲液平衡的赛璐玢渗透性玻璃纸或透析膜。

④在转移夹层顶部放置顶电极。

⑤小心将高压导线和电源相连,在恒流下转移蛋白。通常只需1h。

一般电流不要超过0.8mA/cm2,对于典型的微型胶(8cm×10cm)和标准胶(14cm×14cm),分别为60mA和200mA。通过直接接触凝胶上部监测转印装置的温度,不要超过45℃,如超过,应减小电流。

⑥电转完毕,关闭电源,取出膜,做好标记。

4.免疫检测

加入抗体前,需将膜在封闭剂中封闭,以防止抗体非特异性结合在膜上。一抗识别目的蛋白,二抗识别一抗的Fc段。二抗标记有酶或其他显色系统,如辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶(AP)、免疫金和125I标记的二抗系统,如表9-5所示。

表9-5 发色和发光显迹方法

 

检测步骤:

①膜的封闭:将膜放入适量的3%BSA/TBS溶液,轻摇30~80min。

②洗膜:弃去封闭液,用TBS洗膜三次。

③一抗:弃去TBS,加入一抗(用0.5%BSA/TBS进行适当稀释),适当的稀释度将有助于得到低背景和高特异性。温和摇动至少1h,或过夜。

④洗膜:弃一抗,用TBS洗膜两次,每次10min。

⑤二抗:弃去TBS,加入二抗(用0.5%BSA/TBS进行适当稀释),温和摇动至少1h,或过夜。

⑥洗膜:弃二抗,用TBS洗膜30min,洗3次。

⑦加入显迹溶液,避光显色至出现条带时放入重蒸水中终止反应,晾干,拍照。

 

 

三、应用实例

 

实例1:运用FQ RT-PCR和蛋白质免疫印迹检测连接蛋白Claudin-1在人类大肠癌细胞株的表达

陈琳等为探讨密连接蛋白Claudin-1与人类大肠癌进展的关系,采用实时荧光定量RT-PCR(FQ RT-PCR)和蛋白质免疫印迹,检测Claudin-1在3株不同分期人类大肠癌细胞株中的表达。

FQ RT-PCR结果如图9-24,显示Claudin-1的mRNA表达量:SW620>SW480>SW116。图9-25为蛋白质免疫印迹检测Claudin-1蛋白水平,显示Claudin-1的蛋白水平表达量,用Image-Pro Plus5.0软件分析条带灰度值,得出Claudin-1蛋白表达水平:SW620>SW480>SW116。

 

图9-24 FQ RT-PCR检测Claudin-1结果

(资料来源:陈琳,2007)

 

图9-25 Western blot检测Claudin-1蛋白水平

(资料来源:陈琳,2007)

结果显示Claudin-1在人类大肠癌细胞株中有表达,其表达量与大肠癌分期有关。

实例2:蛋白质免疫印迹法检测牛脑组织中的BSE病原

马贵平等运用蛋白质免疫印迹法检测牛脑组织中的BSE病原,结果如图9-26。

 

图9-26 蛋白质免疫印迹对中国牛脑组织疯牛病检测结果

(资料来源:马贵平,2006)

每个牛脑组织的样品悬液均分成2份,一份用蛋白酶K处理(PK+),见图9-26中的4、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29列;另一份未被蛋白酶K处理(PK-),见图9-26中的3、6、8、10、11、12、14、16、18、20、22、24、26、28列。SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹检测后,在蛋白酶K处理的牛脑组织中没有检测到耐受蛋白酶K水解的PrPsc。第1列为未被蛋白酶K处理(PK-)的10%疯牛病牛脑组织悬液,第2列为用蛋白酶K处理(PK+)的10%疯牛病牛脑组织悬液,结果呈阳性。第3列为未被蛋白酶K处理(PK-)的10%健康牛脑组织悬液,第4列为被蛋白酶K处理(PK+)的10%健康牛脑组织悬液;第5列为重组PrP对照。检测结果说明被检牛为疯牛病阴性。

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