王大虎

王大虎:酶联免疫吸附分析

王大虎

一、基本原理

酶联免疫吸附分析(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)的基本原理是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性,又保留酶的活力。在测定时,受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体发生反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体,也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,间接地放大了免疫反应的结果,使测定方法达到很高的敏感度。

二、检测类型

ELISA可用于检测抗原,也可用于检测抗体。检测方法中有三个必要的试剂:①固相的抗菌素原或抗体,即“免疫吸附剂”;②酶标记的抗原或抗体,称为“结合物”;③酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件,可设计出各种不同类型的检测方法。用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型:

(一)双抗体夹心法测抗原

双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,操作步骤如下:

①将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。

②加受检标本,保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。

③加酶标抗体,保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。

④加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色,测知标本中抗原的量。

在临床检验中,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的特异性抗体,就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清,包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体,一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗,分别用于包被固相载体和制备酶结合物。

双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原,因其不能形成两位点夹心故不适用于测定半抗原及小分子单价抗原。

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(二)双抗原夹心法测抗体

反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物,以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释,可直接用于测定,因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备,应根据抗原结构的不同,寻找合适的标记方法。

(三)间接法测抗体

间接法是检测抗体常用的方法,其原理为利用酶标记的抗抗体(抗人免疫球蛋白抗体)以检测与固相抗原结合的受检抗体,故称为间接法,操作步骤如下:

①将特异性抗原与固相载体联结,形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。

②加稀释的受检血清,保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合,形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后,固相载体上只留下特异性抗体,血清中的其他成分在洗涤过程中被洗去。

③加酶标抗抗体。可用酶标抗人Ig以检测总抗体,但一般多用酶标抗人IgG检测IgG抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗抗体结合,从而间接地标记上酶。洗涤后,固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。

④加底物显色。

间接法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。其优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。

间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果,但应尽可能予以纯化,以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质,例如以大肠杆菌为工程酶的重组抗原,如其中含有大肠杆菌成分,很可能与受过大肠杆菌感染者血清中的抗大肠杆菌抗体发生反应。抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物质,例如来自人血浆或人体组织的抗原,如不将其中的Ig去除,实验中也发生假阳性反应。另外如抗原中含有无关蛋白,也会因竞争吸附而影响包被效果。

间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性抗体。病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分。IgG的吸附性很强,非特异IgG可直接吸附到固相载体上,有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中,抗原包被后一般用无关蛋白质(例如BSA)再包被一次,以封闭(blocking)固相上的空余间隙。另外,在检测过程中标本需先进行稀释(1∶40~1∶200),以避免过高的阴性本底影响结果的判断。

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(四)竞争法测抗体

当抗原材料中的干扰物质不易除去,或不易得到足够的纯化抗原时,可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多,结合在固相上的酶标抗体越少,因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的,可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质,直接包被不易成功,可采用捕获包被法,即先包被与固相抗原相应的抗体,然后加入抗原,形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质,然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。竞争法测抗体有多种模式,可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合,抗HBc的ELISA一般采用此法。另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合,洗涤后再加入酶标抗体,与结合在固相上的抗原反应。抗HBe的检测一般采用此法。

(五)竞争法测抗原

小分子抗原或半抗原由于缺乏可作夹心法的两个以上的位点,因此不能用双抗体夹心法进行测定,可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量越多,结合在固相上的酶标抗原越少,最后的显色也越浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。

(六)捕获包被法测抗体

IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中。间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体,因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体,后者将竞争结合固相抗原而使一部分IgM抗体不能结合到固相上。因此如用抗人IgM作为二抗,间接测定IgM抗体,必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理,以除去IgG的干扰。在临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获包被法。先用抗人IgM抗体包被固相,以捕获血清标本中的IgM(其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM)。然后加入抗原,此抗原仅与特异性IgM相结合。继而加酶标记针对抗原的特异性抗体。再与底物作用,呈色即与标本中的IgM成正相关。此法常用于病毒X染的早期诊断。

类风湿因子(RF)能干扰捕获包被法测定IgM抗体,导致假阳性反应。因此中和IgG的间接法近来颇受青睐,用这类试剂检测抗CMV IgGM和抗弓形虫IgM抗体已获成功。

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(七)ABS-ELISA法

ABS为亲和素(Avidin)、生物素(Biotin)、系统(System)的略语。亲和素是一种糖蛋白,相对分子质量60000,每个分子由4个能和生物素结合的亚基组成。生物素为小分子化合物,相对分子质量244。用化学方法制成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小分子形成生物素标记产物,标记方法颇为简便。生物素与亲和素的结合具有很强的特异性,其亲和力较抗原抗体反应大得多,两者一经结合就极为稳定。由于一个亲和素可与4个生物素分子结合,因此ABS-ELISA法可分为酶标记亲和素-生物素(LAB)法和桥联亲和素-生物素(ABC)法两种类型。两者均以生物素标记的抗体(或抗原)代替原ELISA系统中的酶标抗体(或抗原)。在LAB中,固相生物素先与不标记的亲和素反应,然后再加酶标记的生物素以进一步提高敏感度。在早期,亲和素从蛋清中提取,这种卵亲和素为碱性糖蛋白,与聚苯乙烯载体的吸附性很强,用于ELISA中可使本底增高。从链霉菌中提取的链霉亲和素则无此缺点,在ELISA应用中有替代前者的趋势。由于ABS-ELISA较普通ELISA多用了两种试剂,增加了操作步骤,在临床检验中ABS-ELISA应用不多。

三、应用实例

实例1:乙型肝炎表面扰原的测定

蒋玉莲等运用一步夹心法和二步法测定乙型肝炎表面扰原(HBsAg),用时间分辨定量后的标本,采用阴性混合血清稀释高浓度和低浓度两种不同的实验样本,再用ELISA法测定吸光度(A),分别记录和分析结果(以双波长的A计算)。如图9-27所示,在样本中HBsAg浓度在40.0ng/mL较低的浓度范围内,一步夹心法和二步法显色均随样本浓度的升高而增强;在大于20000.0ng/mL较高的浓度范围内,一步法显色产生“钩状效应”(HOOKeffect),显色与样本浓度曲线呈抛物线形状,二步法随样本浓度的升高显色相对稳定,为L形曲线。

图9-27 显色与样本含量关系

(资料来源:蒋玉莲,2008)

一步法:在向包被反应孔中加入待测物的同时加入酶结合物一起温育,一步即完成反应过程,一步法ELISA的反应曲线为抛物线,也就是说测定随着待测物中抗原浓度的增加而不显色,即此时会产生所谓的“钩状效应”,结果呈现假阳性或假阴性。

上式中a为最后测定结果的显色源,当待测物中Ag浓度增加时,无疑会使b、c和d复合物增加,从而消耗有限的Ab*,使a复合物相应减少,显色降低,而使吸光度对抗原浓度的变化曲线成抛物线,且由于d复合物的形成,使得在同样的Ab浓度下,在未达到饱和状态之前,一步法较二步法颜色浅,此现象在较低浓度的标本中尤其明显。

二步法:在向包被反应孔中加入待测物温育洗板之后,再加入酶结合物二步完成反应过程。反应方程式如下:

二步法实验中,随着待测物中抗原浓度的逐步增加,将使固相抗体与抗原的结合逐步达到饱和,这样在一定浓度Ab*的存在下,Ab·Ag复合物的形成将直接与Ab结合,抗原浓度的逐步增加导致了显色的逐步加深,而形成L形变化曲线。

实例2:口蹄疫病毒非结构蛋白的测定

付元芳等利用原核表达系统表达了口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白(NSP):3A、3B和富含B细胞抗原位点序列的2C蛋白。利用高浓度尿素裂解包涵体,采用稀释法和氧化型、还原型谷胱甘肽系统相结合方法对2C蛋白进行复性。用金属螯合亲和层析的方法对表达的3A、3B和2C蛋白进行纯化。采用ELISA方法对比检测了3种纯化蛋白在检测羊血清NSP抗体的效果。

由图9-28可知,3A和3B为可溶性表达蛋白,2C以包涵体形式表达。融合蛋白的N末端带有标记的6个组氨酸残基,利用组氨酸对Ni-NTA的强吸附力,以镍离子亲和层析纯化融合蛋白,经SDS-PAGE分析,分别得到24、15和23ku的蛋X,见图9-29(1)。通过蛋白质免疫印迹分析,表明纯化后蛋白质能与来自感染牛的FMDV阳性血清发生反应,见图9-29。

图9-28 表达产物的SDS-PAGE(1)和可溶性分析(2)

M—标样 (1)图中,1—无IPTG诱导下的重组蛋白 2和3,4和5,6和7—IPTG诱导下3A、3B以及2C重组蛋白 (2)图中,1、3和5—3A、3B和2C重组细胞的上清液 2、4、6—3A、3B、2C重组细胞的沉淀

(资料来源:付元芳,2008)

图9-29 纯化后目的蛋白的SDS-PAGE(A)和蛋白质免疫印迹分析(B)

M—标样 1—纯化后3A融合蛋白 2—纯化后3B融合蛋白 3—纯化后2C融合蛋白

(资料来源:付元芳,2008)

将纯化蛋白包被酶标板,采用与3ABC间接ELISA相同的反应程序进行检测。结果显示,纯化蛋白能够与FMDV感染动物血清发生特异性反应,而与健康动物血清不反应。并经方阵试验测得分别以3A 10ng、3B 118ng和2C 46ng抗原为最佳包被量,表明纯化后的融合蛋白具有很好的反应活性(图9-30)。用上述抗原工作浓度包被酶标板,进行间接ELISA,检测180份田间羊血清,以已知的羊阳性和阴性血清为对照,并将检测结果与3ABC试剂盒和3D抗原检测结果做进一步对比分析,结果见表9-6。检测得知,以3A、3B和3ABC为抗原的检测结果和3ABC的检出结果最接近,2C和3D的检测结果与3ABC的符合率稍低,但也是重要的检测参考指标。

图9-30 间接ELISA滴定纯化3A、3B和2C蛋白的抗原效价

+为FMDV NSP阳性血清;-为FMDV NSP阴性血清;Cattle、Swine、Sheep分别指血清来源:牛、猪、羊。

(资料来源:付元芳,2008)

表9-6 5种抗原ELISA检测羊血清的结果比较

单个NSP抗体检测的方法对不同宿主进行检测时,可能存在漏检和出现假阳性的问题。为了提高检测准确性,这就需要建立同时检测多个NSP抗体的方法,以提高NSP抗体检测方法的敏感性和对某些临界值血清的检出率。

 

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