王大虎

王大虎: 第四节质谱技术

王大虎

一、基本原理

质谱分析技术是通过正确测定蛋白质分子的质量而进行蛋白质分子鉴定、修饰和蛋白质分子之间相互作用的一种研究方法。质谱仪通过测定离子化生物分子的质荷比便可得到相关分子的质量。但长期以来,质谱方法仅限于小分子和中等分子的研究,因为要将质谱应用于生物大分子需要将之制备成气相带电分子,然后在真空中物理分解成离子。但如何使蛋白质分子经受住离子化过程转成气相带电的离子而又不丧失其结构形状是个难题。20世纪70年代,解吸技术的出现成功地将蛋白质分子转化成气相离子。然后快原子轰击与其紧密相关的溶液基质二次离子质谱法使得具有极性的、热不稳定的蛋白质分子可经受住电离过程。但这些方法仅限于10ku以下蛋白质分子的研究。80年代电喷雾电离(ESI)和软激光解析(SLD)电离技术的发展则使得质谱方法应用于高分子质量蛋白质分子的研究。

质谱法按照离子的质荷比(m/z)大小对离子进行分离和测定,被分析的样品首先要离子化,然后利用不同离子在电场或磁场运动行为的不同,把离子按质荷比分开,并通过相应检测分析手段从而得到质谱图。

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二、检测过程

质谱分析过程主要包含三个部分:离子化、质量分析和离子检测。下面从这三方面介绍其检测过程。

(一)离子化技术

质谱分析被认为是测定小分子的分子质量最准确最灵敏的方法。由于生物样品不稳定,电子轰击电离(EI)、化学电离(CI)等传统电离技术不适用于生物样品。20世纪末以来,有机质谱的迅速发展引人注目。1981年,出现了快原子轰击电离(FAB)技术,有人称其为质谱学跨入生物学领域的里程碑,随后相继发展了ESI和基质辅助激光解析电离(MALDI)这两种软电离技术。它们共同特点是能将不挥发的、热稳定性差的生物大分子,如蛋白质、糖蛋白、核酸、寡糖等电离成气相离子,得到很强的与分子质量相关的离子,如[M+H]+、[M-H]-、[M+Na]+、[M+K]+等(其中M为分子质量)。这些软电离技术与碰撞诱导解吸(CID)技术结合,形成了生物大分子结构分析的重要工具。

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1.快原子轰击质谱(Fast Atom Bombardment-Mass Spectrum, FAB-MS)

FAB-MS也称液体二次离子质谱(LSI-MS),是一种用快速原子轰击被分散在高沸点溶剂(如甘油)中的待测化合物,从而产生分子离子。快原子的产生是通过电离惰性气体Ar,Xe或He产生的Ar+,Xe+或He+被电场加速,从而具有较大动能,然后通过Ar气室进行电荷交换反应如下所示。

经电荷交换后的Ar+被偏转出快原子流,获得高动能的Ar原子对样品分子进行轰击,一般样品调在甘油基质之中,当快原子束轰击在涂有样品的金属板上(图9-31),快原子大量动能以各种方式消散,其中的一些能量导致样品的挥发和解离。

图9-31 FAB源示意图

(资料来源:何美玉,2002)

FAB是一种弱离子化技术,方法要求简单,灵敏度较高。FAB产生的分子离子稳定,不易裂解,是准确测定多肽化合物分子质量的有效方法。FAB能与HPLC、CEZ等方法结合使用达到分离分析的目的,现在许多多肽的FAB分析方法已经建立,并得到很好的应用。

由于不易获得碎片峰,FAB-MS在测定多肽顺序时遇到困难,所以应用了另一种叫串联质谱(MS/MS)的技术。它是把FAB出来的分子离子(MS-1)和惰性原子再一次轰击(碰撞诱导解离,CID或称结合活化碰撞解离,CAD),从而获得一张碎片图谱(MS-2)。这样,对于一些蛋白质裂解的多肽碎片,可从MS/MS上得到分子质量值及顺序信息。对于一些较复杂的多肽混合物,可先从FAB上得到每个组分的分子离子,再通过CID或CAD对其中某一个或全部离子依次分析。

2.电喷雾离子化质谱(Electrospray Ionization-Mass Spectrometry, ESI-MS)

ESI是一种使用强静电场的电离技术,样品溶液通过一X细管进入雾化室,在加热、雾化气(N2)和强电场(3~5kV)共同作用下雾化,形成高度荷电液滴,在向质量分析器移动过程,溶剂挥发,液滴变小,表面电荷密度增大,当库仑斥力增大到足以抵抗液滴表面张力时(瑞利极限),液滴分裂,最终在不断增强的库仑斥力作用下,溶液中样品分子以离子形式溢出,进入气相,如图9-32所示。在正离子模式下,分子结合H+、Na+或K+而得到[M+H]+、[M+Na]+或[M+K]+;在负离子模式下,活泼氢电离得到[M-H]-。这种软电离方式非常适用于亲水性强、不耐高温的生物分子。

图9-32 ESI-MS示意图

(资料来源:X,2005)

3.基质辅助的激光解吸离子化质谱(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Mass Spectrum, MALDI-MS)

激光解吸电离质谱(LDI-MS)早就作为分析难挥发有机物的方法之一,曾用于分析合成聚合物和热不稳定生物小分子的研究。化合物吸收激光时才能产生解吸,对于吸收不好的物质,需要加大辐射量,而这容易破坏生物大分子结构,使分子离子峰大大减弱。直到1988年,科学家提出使用MALDI-MS,发展了LDI-MS在生物大分子领域的应用。

MALDI-MS中将待分析样品(µmol/L级浓度)的溶液和基质(mmol/L级浓度)溶液相混合,基质分子在一定波长下能强烈吸收激光,获取能量,使基质与样品雾化进入气相并得到电离(图9-33)。待测离子质量可以通过分析飞行时间(TOF)来测定。基质的选择主要取决于选用的激光波长,其次是被分析对象的性质,如表9-7所示。

图9-33 MALDI-MS示意图

(资料来源:X,2005)

表9-7 MALDI常用基质

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(二)质量分析技术

1.单聚焦分析

一个质量为m的,电荷价态为z的离子(正电荷),经电压为U的电场加速,获得动能zeU,并以速度υ运动出电场,忽略加速前的热运动,则有:

式中z——电荷数,个;

e——元电荷(e=1.60×10-19C),C;

U——加速电压,V;

m——离子质量,g;

υ——离子速度,m/s。

离子经电场加速X入磁场,在洛伦兹力作用下做圆周运动,受到的向心力与离心力平衡:

式中B——磁场强度,A/m;

r——曲率半径,m。

由上述两式消去υ得:

可见,不同质量的离子具有不同的轨道半径,质量越大,轨道半径越大,意味着磁场具有质量色散能力,可单独用作质量分析器。不过,如果改变加速电压U,离子动能将改变,在磁场中的轨道半径也将改变,这是磁场的能量色散能力,也是影响单聚焦分析器分辨率的原因。在离子源产生的离子当中,质量相同的离子由于初始能量差异,在磁场中轨道半径不同而不能汇聚一起。

在一定的B、U条件下,如果检测器位置不变(即r不变),连续改变U或B可以使不同质荷比的离子依次进入检测器,实现质量扫描,得到样品的质谱,这就是单聚焦分析器,如图9-34所示。这种单聚焦分析器可以是180°的,也可以是90°或其他角度的,因其扇形形状,故又称磁扇形分析器。

 

图9-34 单聚焦分析器原理图

(资料来源:何美玉,2002)

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2.双聚焦分析

双聚焦分析器是在单聚焦分析器的基础上,为了消除离子能量分散对分辨率的影响,在扇形磁场前设置一个能量分析器——扇形电场(无质量色散作用)。

将离子垂直X由一对半径分别为r1、r2的同轴扇形柱面电极构成的静电场,离子做半径为re的运动,受到电场力与离心力平衡,有:

 

式中 Er——离子轨道上电场的强度,V/m。

已经知道离子动能为,带入式9-7,得到:

 

当Er固定,加速电压U(对应于离子动能)的改变将导致轨道半径的改变,此扇形电场是能量分析器。

如果设法使静电场的能量色散作用和磁场的能量色散作用相互抵消,就可以消除能量分散对分辨率的影响。只要是质量相同的离子,经过电场和磁场后就可以会聚在一起,改变加速电压U可以实现质量扫描。这种由电场和磁场共同实现质量分离的分析器,同时具有方向聚焦和能量聚焦作用,称双聚焦质量分析器,如图9-35所示。

 

图9-35 双聚焦分析器原理图

(资料来源:何美玉,2002)

3.四极杆质量分析

四极杆是由两对相互平行的、横截面为双曲面或圆形的极杆构成,如图9-35所示。在一对电极上加电压U+Vcosωt,另一对上加电压-(U+Vcosωt),其中U是直流电压,Vcosωt是射频电压,形成一个四极场,其中任意一点上的电位:

 

当质荷比为m/z的离子沿z轴方向X四极场时,其运动方程为:

 

令,ξ=ωt/2,上述方程可简化为:

 

上述两个方程是著名的马绍方程(Mathieu equation),是描述离子在四极场中运动规律的基本方程。我们只需关心离子沿z轴X后,能否通过四极杆得到分离检测,即离子在场中的运动轨道是否稳定,在x、y轴方向上的振幅是否小于场半径r0。换句话说,问题就是由U、V、m、r0、ω这些参数所决定的a、q的值能否使马绍方程有稳定的解。可以通过以a、q为坐标的稳定图来说明,如图9-36。

 

图9-36 四极杆质量分析器原理图

(资料来源:陈耀祖,2000)

图9-37中a、q值在不稳定区的离子因产生不稳定振荡而被电极中和。扫描线是斜率(a/q)为常数,通过原点的直线并与稳定三角形边界相交于两点,位于两点之间线上的离子都是稳定的。显然,a/q值越大,稳定区内的质量范围越窄,分辨率就越高。可以看出,四极杆质量分析器实际上是种质量过滤器。

 

图9-37 马绍方程稳定三角形图

(资料来源:陈耀祖,2000)

四极杆分析器可串联构成串联质谱,如三级四极质谱仪,Q1-Q2-Q3,其中Q1、Q2是两个分析器,Q3是个只有射频电压的碰撞室。

4.离子阱质量分析器

如果将四极杆质量分析器的两端加上适当的电场将其封上,则四极杆内的离子将受x、y、z三个方向电场力的共同作用,使得离子能够在这三个力的共同作用下比较长时间滞留在稳定区域内,就像一个电场势阱,这样的器件被称为离子阱。在很多时候都认为四极杆质量分析器与离子阱的区别是前者是二维的,而后者是三维的。

离子由一个环电极(ring)、两个端盖电极(endcap)组成,横截面均为双曲面,端盖接地,如图9-38所示。与四极杆分析器类似,离子在离子阱内的运动遵守马绍方程,也有类似四极杆分析器的稳定图。在稳定区内的离子,轨道振幅保持一定大小,可以长时间留在阱内,不稳定区的离子振幅很快增长,撞击到电极而消失。通过改变直流电压U、射频电压Vrf的值,使特定质量的离子处于稳定区或者不稳定区,在引出电极上加负电压,可以将离子从阱内引出,由电子倍增器检测。因此,离子阱的质量扫描方式与四极杆类似,是在恒定的U/Vrf下,扫描Vrf获取质谱。

 

图9-38 离子阱质量分析器原理图

1—灯丝 2—端盖 3—环形电极 4—电子倍增器 5—计算机 6—放大器和射频发生器(基本射频电压) 7—放大器和射频发生器(附加射频电压)

(资料来源:X,2006)

离子阱具有很多优点,性价比高,灵敏度高,较四极质量分析器高10~1000倍,质量范围大等。这些优点使得离子阱质谱器在物理学、分析化学、医学、环境科学、生命科学等领域中获得了广泛的应用。

串联质谱分空间串联和时间串联两种,如图9-39所示。空间串联是由几个质量分析器串联而成。单一离子阱可实现时间上的串联质谱:用一级质谱筛选要研究的离子,使其进入碰撞区与惰性气体碰撞,经过CID产生的产物由二级质谱进行分析。MS/MS可以获得子离子谱、母离子谱、恒定中性丢失谱及作多反应监测等。

 

图9-39 (1)MSn的空间串联 (2)MSn的时间串联

(资料来源:X,2006)

5.飞行时间质量分析器

飞行时间质量分析器(TOF-MS)由离子源引出极、漂移区和检测器组成,如图9-40所示。离子在离子源里产生,在加速电压U作用下,有:

 

 

经过长度为L的漂移管到达检测器,所需时间:

 

图9-40 飞行时间质谱示意图

(资料来源:陈耀祖,2000)

 

整理可得:

 

或简写为m=At2,A为常数。质量越大,速度越小,到达检测器的时间越长,测定离子在漂移区内飞行时间即可计算出其质荷比,即离子的分析时间谱可转换成质谱图。

早期的线性飞行时间质谱,分辨率较低,原因在于离子的形成时间、初始动能、在离子源中的位置及运动方向等因素都将影响检测结果。

对m=At2微分可得:

 

可得

 

分辨率可表示为:

 

可见,降低加速电压U、增加漂移管长度L,可延长飞行时间t,提高分辨率。

质量相同的离子在不同时间离开离子源或能量不同,那么飞行时间就不同,导致分辨率低,解决此问题方法有:两级加速技术与离子反射技术。

两级加速技术如图9-41(1),离子在被加速到最终动能之前先被引出极A加速,由于电位梯度,离引出极A较远的离子将比较近的获得更多的动能,以此补偿减小空间发散和能量不均。

 

图9-41 两级加速技术与离子反射技术示意图

(资料来源:陈耀祖,2000)

离子反射技术如图9-41(2),离子进入减速反射区,动能较大的进入该区较深,反射回来到检测器的时间也较长,以此补偿离子初始能量的差异。

6.傅里叶变换离子回旋共振质谱(Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance-Mass Spectrometry, FT-ICR-MS)

FT-ICR-MS的核心是个立方分析池(也有其他形状的),由三对相互垂直的平行板电极组成,置于高真空和由超导磁体产生的强磁场中。第一对电极为捕集极,它与磁场方向垂直,电极上加有低直流电压,形成静电场将离子限制其中;第二对电极为发射极,用于发射射频脉冲;第三对电极为接收极,用来接收离子产生的信号,如图9-42所示。

 

图9-42 FT-ICR-MS分析池示意图

(资料来源:陈耀祖,2000)

离子引入分析池后,在强磁场作用下被迫以很小的轨道半径做回旋运动,离子受到的洛伦兹力与离心力平衡:

 

因为υ/r=ω=2πf,所以f=zeB/(2πm)。

式中ω——角速度;

f——回旋频率(Hz)。

可见回旋频率与离子质荷比成反比,与磁场强度成正比,而且与初速度无关,所以当离子进入分析池后,在磁场中做回旋运动。质量相同的离子,回旋频率相同,而半径会因为其初速度不同而不同。

如果在发射极加一个频率与离子回旋频率相同的射频电压,这些离子将与其产生共振,离子获得能量后回旋半径逐渐增大,最后趋于一致,但回旋频率不变。轨道半径为:

 

其中,Arf是射频脉冲大小,t为脉冲的时间。正离子在池中做回旋运动,并在接收极上感应出“像电流”。在离子激发过程中,若在发射极上加上很快的射频扫描(RF chirp),其频率范围覆盖的其中所有离子的频率,所有离子几乎同时被激发,并在接收极上感应出相应的“像电流”,停止激发后,所有离子都同时从共振状态回落,在接收极上形成一个X感应衰减信号,此信号包含了所有被分析离子的信息,通过电学仪器放大和记录,得到时域谱。为了从时域谱中得到每一个质荷比的离子的频率成分,常用傅里叶变换的方法计算,得到频域谱。由于离子的质荷比与其共振频率具有一一对应关系,以参比化合物建立频率和质量关系,频域谱即可转化为质谱。

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