王大虎

王大虎:离子检测技术

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1.法拉第盘(杯)

法拉第盘(杯)是将一个具有特定结构的金属片接入特定的电路中,收集落入金属片上的电子或离子,然X行放大等处理,得到质谱信号,如图9-43所示,抑制电极加负压以抑制二次电子跑出。一般来说,这种检测器没有增益,其灵敏度非常低,限制了它的用途。

 

图9-43 法拉第盘(杯)示意图

(资料来源:X,2006)

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2.电子倍增器

电子倍增器有分离式和隧道式,如图9-44所示。检测原理:当具有较高动能的正离子打在特制材料制作的打拿极上,打拿极释放出具有一定的初动能二次电子,在电场作用下,电子被加速并再次打在另一个打拿极上,产生更多电子,如此重复,在具有连续电势梯度的倍增管中不断放大。

 

图9-44 电子倍增器示意图

(资料来源:X,2006)

与法拉第盘相比,电子倍增器具有灵敏度高、噪声低、响应快、对空气稳定、能直接接收离子等优点,局限是不能检测负离子。

3.微型多通道板(MCP)检测器

由于单个的电子倍增器的空间分辨能力差,人们将微型化的电子倍增器并联,集成为MCP检测器。电子倍增器的增益取决于管长与内径之比,因此可以减小内径而不损失增益。多个MCP串联可增大增益。由于MCP的电子路径较短,得到的信号脉冲较窄(约1ns),噪音较低,线性动态范围较宽(104~108)。

4.闪烁检测器(IPD)

离子束先被加速,然后打击到金属电极产生二次电子,再用二次电子打击闪烁器产生光子,最后用光电倍增器进行检测。

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5.低温检测器

当粒子撞击超导薄膜表面,能量累积并产生热量,表面溅X中子、离子、电子和光子,可在低温下(<3K)检测,从而提供离子速率和能量的信息。低温检测器具有100%的效率、无质量歧视、理论上无质量上限等优点。

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三、应用实例

实例1:CNBr裂解结合电喷雾串联质谱测定电泳分离蛋白的C末端序列

高彦飞等建立了CNBr裂解结合电喷雾串联质谱测定蛋白质C末端序列的方法,并应用于重组人X坏死因子受体(rhTNFR)和纽兰格林(neuregulin)的C末端测序。首先根据待测蛋白质序列进行CNBr理论裂解,如果C末端肽段理论分子质量在500~5000u,则将待测样品进行SDS-PAGE分离,考马斯亮蓝染色,然X行胶内CNBr裂解,最后应用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定C末端肽段的分子质量,电喷雾串联质谱对C末端肽段进行测序。应用该方法分别测定了rhTNFR和纽兰格林这两个蛋白质C末端19个和11个氨基酸残基序列。

(1)CNBr裂解产物的MALDI-TOF-MS检测 rhTNFR和重组人纽兰格林序列均已知,通过对其序列进行理论CNBr裂解判断其C末端肽段的分子质量。常用的理论酶切软件有PeptideMass、PeptideCutter(http://cn.expasy.org)等以及部分质谱公司软件。经分析,rhTNFR和重组人纽兰格林的C末端肽段理论[M+H]+分别为2147.10与1348.63。如图9-45所示,经MALDI-TOF-MS检测,可以找到这两个肽段且相对强度高,很有利于序列测定。根据序列推测,图9-45(1)中质荷比为2018.88肽段为末端缺失赖氨酸K的C末端肽段。

图9-45 rhTNFR(1)和重组人纽兰格林(2)CNBr裂解MALDI-TOF-MS图

(资料来源:高彦飞,2008)

(2)CNBr裂解产物的ESI-MS/MS检测 为进一步确认,分别选择rhTNFR和重组人纽兰格林的C末端肽段进行MS/MS分析。与MALDI-TOF-MS不同,分子质量在700u以上的肽段在电喷雾质谱中很容易形成多电荷离子。因此选择rhTNFR中质荷比为716.33三电荷离子进行MS/MS分析。结果表明:其C末端19个氨基酸(HEALHNHYTQKSLSLSPGK)与理论序列完全一致,如图9-46所示。实验选择重组人纽兰格林中质荷比为674.87双电荷离子进行测序,结果表明:其C末端11个氨基酸(ASFYKAEELYQ)序列与理论序列一致,如图9-47所示。[M+H]+为2018.88u的肽段序列测定表明rhTNFR的C末端缺失K的现象确实存在(图略),且比例较高[图9-45(1)]。rhTNFR的C末端K缺失是否与活性有关需要进一步研究。

图9-46 重组人TNFR C末端肽段(m/z为716.33)的MS/MS测序图

(资料来源:高彦飞,2008)

图9-47 重组人纽兰格林C末端肽段(m/z为674.87)的MS/MS测序图

(资料来源:高彦飞,2008)

实例2:液相基质辅助激光解吸电离-傅里叶变换离子回旋共振质谱研究

熊少祥等使用α-氰基肉桂酸、3-氨基喹啉和甘油以1∶2∶3(质量比)配制的液体基质制样,考察了激光强度、回旋池开门时间等因素对基质辅助激光解吸电离-傅里叶变换离子回旋共振质谱(MALDI-FT-ICR-MS)检测结果的影响,优化了实验条件。使用液相制样方法对5类实际样品进行了MALDI-FT-ICR-MS检测,结果表明:液相基质具有很好的通用性,质谱信号稳定、持久。利用FT-ICR-MS特有的超高分辨率与准确度,能够很准确地测定化合物组成。

选择激光透过率100%,以获得较强的信号以及较高的灵敏度。不同质量的离子进入回旋池时的飞行速度不同,质量小的快,质量大的慢,从而导致它们进入回旋池和停留时间不同,所以回旋池门开启的时间对能否检测到被测物及其信号强度有着很大的影响,必须控制好回旋池门的开启时间长短(即前端捕获电极施加电压和不施加电压的时间间隔)。实验中通过调节仪器参数P2来控制这一时间的长短。图9-48所示为将不同质量的5种四硫富瓦烯化合物混合后,考察回旋池开启时间(即参数P2的变化)对各化合物信号的影响,图中A、B、C、D、E和F就是当P2分别为500、800、900、1000、1300和1600时,得到的四硫富瓦烯化合物的混合物的质谱图,可知,除A与F外,其余质谱图中化合物的峰强,并且随着P2值从小到大变化,检测到的化合物质量也由小变大。A中没有检测到任何离子峰是由于P2值太小,回旋池开启的时间过短,此时,即使是飞行得最快的质荷比为460.8657离子尚未飞进回旋池。F中是由于P2值过大,即使是飞行得最慢的质荷比为1068.3931离子也已飞出回旋池。

图9-48 回旋池门开启时间(P2)对峰强度影响

P2—A 500;B 800;C 900;D 1000;E 1300;F 1600

(资料来源:熊少祥,2004)

为确证使用液相制样分析样品的可行性,使用液相制样对不同结构类型的5类共20个实际样品进行了MALDI-FT-ICR-MS检测。

表9-8列出了这些化合物的分子组成和质谱分析结果。可以看出,无论测定的是酸性或碱性多肽,都能检测出离子信号。这是由于液体基质中既有碱性的3-氨基喹啉又有酸性的α-氰基肉桂酸,它对酸性的多肽和碱性的多肽都能很好地溶解和检测。

表9-8 样品及质谱分析结果

图9-49为皂苷、四硫富瓦烯、杯芳烃和酞菁化合物中某一具体样品的结构。图9-50为4种具体的多肽、皂苷、四硫富瓦烯、杯芳烃化合物的质谱图。图9-51(1)是多肽化合物1(序列为NH2-G-C-L-S-R-S-G-Y-G-C-G-COOH)的质谱图,从测得的高准确度质量数可以很容易地推算出它的元素组成为C41H66O15N14S2,与理论值一致。

图9-49 4种化合物的结构

(资料来源:熊少祥,2004)

图9-50 4种不同样品的质谱图

(资料来源:熊少祥,2004)

皂苷化合物1的结构见图9-49(1),其MALDI-FT-ICR-MS结果见图9-50(2),图中质荷比为823.2637和839.2272的离子峰经计算是元素组成为C36H48O20化合物的[M+Na]+峰及[M+K]+峰,实验未检测到该化合物的[M+H]+峰。

杯芳烃化合物的结构见图9-49(3),其MALDI-FT-ICR-MS结果见图9-50(4)。其中质荷比为957.4746的离子峰经过计算是元素组成为C56H70O12化合物的[M+Na]+峰,而质荷比为973.4439的离子峰则是它的[M+K]+峰,实验未检测到该化合物的[M+H]+峰。

由于在皂苷化合物和杯芳烃化合物的分子结构中含有大量易于加Na、加K的羟基、醚键和酯键,抑制了这两类化合物[M+H]+峰的产生。对其他皂苷与杯芳烃化合物样品的质谱图中也仅出现[M+Na]+峰和[M+K]+峰。

四硫富瓦烯化合物的结构见图9-49(2),其MALDI-FT-ICR-MS结果见图9-50(3)。在MALDI-FT-ICR-MS条件下,四硫富瓦烯化合物很容易解吸电离生成单电荷的分子离子M+。与多肽、杯芳烃等物质不同,该类化合物不生成[M+Na]+、[M+K]+离子,尽管分子结构中大都存在易于加N、加K的醚键、酯键,此种特点反应了它们通常作为电子受予体的富电子特征。

酞菁的结构见图9-49(4),其MALDI-FT-ICR-MS结果见图9-51(1)。从[M+H]+的同位素分布看出其结构含有金属。通过所检测到的准确质量数,可以推算出该化合物的元素组成,即C48H49N8Zn。为得到进一步证实,元素组成为C48H49N8Zn化合物的[M+H]+峰的理论同位素峰形见图9-51(2),比较可知,两者的同位素峰形比较吻合,从而证实所测化合物就是元素组成为C48H49N8Zn的化合物。

图9-51 元素组成为C48H49N8Zn的酞菁化合物实验

(1)实验结果 (2)理论结果(m/z=801.3373)

(资料来源:熊少祥,2004)

第五节 肽图谱技术

一、基本原理

肽图谱分析技术,是指蛋白质经特定蛋白酶或化学方法降解,得到具有一定特征性的肽混合物,再经一定的分离检测手段得到蛋白质的肽图谱,或称肽谱、指纹谱,用于蛋白质的分析鉴定。

多肽除了分子质量与蛋白质有区别外,其功能性与蛋白质也有所不同。多肽是体现信息的使者,可以引起各种各样的生理活动和调节生化反应;生物活性高;分子小,结构易于改造,相对于蛋白质而言较易人工化学合成;通过多肽的片断可以深入研究蛋白质的性质,并且为改变和合成新的蛋白质提供基础材料。随着蛋白质组学和质谱技术的飞速发展,越来越多的研究者开始关注多肽,并随之形成了以蛋白质组学为基础的多肽组学(Peptdomics)。

二、研究方法

肽图谱分析技术涉及的分离检测技术包括SDS-PAGE、二维凝胶电泳(2-DE)、HPLC、CE、质谱分析等。

肽图谱分析最早称为fingerprinting(指纹术),用在血红蛋白A(Hb A)和血红蛋白S(Hb S)的分子病研究中,即将Hb A和Hb S分别用胰蛋白酶酶解,并分别进行纸电泳,再转动90°进行纸层析,得到Hb A和Hb S的肽图谱,以此比较到肽斑点上的差别,并进一步分析氨基酸序列上的差异。

早期的遗传工程产品的肽图谱分析采用SDS-PAGE,操作相对简单,但SDS-PAGE对小分子肽的分辨能力有限,在染色脱色过程可能丢失。1975年由Klose和O’Parre发明二维电泳之后,二维电泳就成为蛋白质组学研究普遍而有力的工具,也是肽图谱分析技术之一。

HPLC在肽图谱技术中的应用,主要是RP-HPLC,根据肽段的大小、疏水性来分离。使用易挥发的有机溶剂作流动相,与ESI质谱有较好的匹配性。对于疏水性相同或相近的多肽,RP-HPLC则难以分辨,而CE可以胜任,CE具有快速、高效、样品消耗少等优点,多种工作模式可供选择,应用范围广泛。

二维凝胶电泳技术、计算机图像数据处理技术和质谱技术被称为蛋白质组学研究的三大支撑技术,而肽质量指纹谱(Peptide Mass Fingerprinting, PMF)技术涉及胶上蛋白原位酶切、MALDI-TOF-MS,并结合国际互联网蛋白质数据库,是蛋白质组研究中应用最多的技术。另外,FAB-MS、ESI-MS等均可运用于肽图谱分析。质谱分析可精确测定分子质量,与蛋白序列获得的理论计算的分子质量相比较,从而快速鉴定蛋白质的结构以及蛋白质的翻译后修饰或突变位点等。

肽图谱分析可以鉴定蛋白质的结构、翻译后修饰以及突变等情况,是蛋白质组研究中十分重要工作,也是从蛋白质的角度研究疾病的重要途径。

三、应用实例

实例1:重组L-天冬酰胺酶Ⅱ的纯度分析与肽图谱测定

韩俊等为了对重组L-天冬酰胺酶Ⅱ进行肽图谱测定,以比较不同来源产品同一级结构的一致性,运用梯度洗脱/RP-HPLC对样品进行纯度检查和肽图谱测定,并提出了简单的三氯乙酸变性方法,以解除蛋白质抗胰蛋白酶水解的能力,从而建立了重组L-天冬酰胺酶Ⅱ的三氯乙酸变性/胰蛋白酶水解测定肽图谱的HPLC方法,如图9-52所示。

图9-52 L-天门冬酰胺酶Ⅱ样品的肽图谱分析

(资料来源:韩俊,1999)

实验用L-天门冬酰胺酶Ⅱ:样品a为对照品;样品b和c分别为进口药物;样品d为国内的基因工程产品。

胰蛋白酶专一裂解Arg和Lys基端的肽键。L-天冬酰胺酶Ⅱ的亚基中含7个Arg和24个Lys,理论上有31个裂解位点,分子内1对双硫键的存在,未经还原/羧甲基化的样品应产生31个肽段。由于酶解反应常难以完全进行(如肽链中Arg或Lys与Pro直接相连情况下),以及胰蛋白酶中残留的胰凝乳蛋白酶等产生的专属位点裂解,实际测得的肽段数高于理论值。由图9-52可知,样品b和c的图谱与样品a的图谱一致,显示三者在此技术范围内结构上具有同一性。样品d的图谱与样品a的图谱相比,a中箭头所示峰为d中箭头所示峰替代,表明肽链中存在氨基酸的变异,亲水性更强的氨基酸取代了原有氨基酸。作者运用电喷雾离子化质谱法对上述4个样品的分子质量进行了测定,结果显示样品a~c的分子质量相同,测得的分子质量均为(34541±1)u,样品d中氨基酸发生变异的位置该方法并未涉及。

实例2:重组人钙调磷酸酶B亚基的纯度和肽图谱分析

高锦等用RP-HPLC法对重组人钙调磷酸酶B亚基(rhCNB)的纯度和肽图谱进行了测定,以比较不同批次产品的纯度及其一级结构的一致性,对其进行质量控制。并用MALDI-TOF-MS法进行验证。结果表明,运用梯度洗脱RP-HPLC法能对样品进行纯度检查和肽图谱分析,测得3批样品纯度均达到98%以上,肽图谱能达到批间一致。同时用MALDI-TOF-MS法测定,纯度结果二者相符,质谱肽图经计算机辅助分析,确证rhCNB一级结构与天然钙调磷酸酶B亚基(CNB)一致。证明该方法灵敏、准确、可靠。

(1)RP-HPLC法测定的rhCNB纯度 如图9-53所示,样品在保留时间tR=43min处有一杂质峰,测得3批样品主峰纯度按峰面积归一化计算均大于98%,符合基因工程药物纯度的要求。

图9-53 rhCNB的RP-HPLC图

(资料来源:高锦,2004)

(2)MALDI-TOF-MS法测定rhCNB的纯度及相对分子质量 如图9-54所示,图谱中有分子离子峰[M+H]+,分子离子多电荷峰[M+2H]2+,[M+3H]3+,[M+4H]4+,多聚体离子峰[2M+3H]3+,[4M+3H]3+及杂蛋白(M*)峰,并可由分子离子峰的相对丰度看出样品的纯度,虽然不能定量,但可以看出样品中含有少量的杂蛋白,与RP-HPLC测得有一杂蛋白峰相符,其可以作为纯度分析的一个辅助手段。rhCNB相对分子质量测定值为19151(理论值为19157),测量误差为0.03%。

图9-54 rhCNB的MALDI-TOF-MS图谱

1—[M+4H]4+ 2—[M+3H]3+ 3、4—杂蛋白[M*+2H]2+ 5—[M+2H]2+ 6—[2M+3H]3+ 7、8—杂蛋白[M*+H]+ 9—[M+H]+ 10—[4M+3H]3+

(资料来源:高锦,2004)

(3)RP-HPLC法分析的rhCNB肽图谱 rhCNB含有169个氨基酸,胰蛋白酶可以特异性水解Lys和Arg残基之后的肽键,CNB中含有6个Arg和15个Lys,酶切位点如下:

GNEASYPLEMCSHFDADEIK↓R↓LGK↓R↓FK↓K↓LDLDNSGSLSVEEFMSLPELQQNPLVQR↓VIDIFDTDGNGEVDFK↓EFIEGVSQFSVK↓GDK↓EQK↓LR↓FAFR↓IYDMDK↓DGYISNGELFQVLK↓MMVGNNLK↓DTQLQQIVDK↓TIINADK↓DGDGR↓ISFEEFCАVVGGLDIHK↓K↓MVVDV。

理论上应有21个裂解位点,产生18个肽段以及2种单氨基酸。但酶解常不完善或在非Arg、Lys残基上切断,因此产生肽段数不一定与理论值相符。本实验将3批rhCNB样品经胰蛋白酶酶解后的肽段用RP-HPLC法分析的各批间肽图一致,如图9-55所示。

图9-55 A、B、C3批rhCNB胰蛋白酶酶切RP-HPLC肽图谱

(资料来源:高锦,2004)

(4)MALDI-TOF-MS法分析的rhCNB肽图谱 对rhCNB经胰蛋白酶酶切后样品进行MALDI-TOF-MS测定,在质谱肽图上可以直接得出肽段的相对分子质量,较HPLC肽图谱更直观,如图9-56所示。仅测相对分子质量为800~3100部分,共测得17个肽段,经计算机数据库辅助分析,其中有13个肽段的相对分子质量与理论值相符,匹配度达76.5%,匹配情况见表9-9。胰蛋白酶专一裂解Arg和Lys基端的肽键,为了与催化位点结合,需一碱性侧链。不过,当碱性侧链后接酸性碱基或被其包围时,赖氨酰肽键常变得不易进行胰蛋白酶水解。而且,后接碱性残基脯氨酸的肽键不适于胰蛋白酶水解。由此可见在Asp-Lys-Asp序列中的赖氨酰残基键最有可能抗胰酶消化,这个序列在rhCNBX现了2次,均未裂解完全,出现3、14号峰。由于酶解不完善所造成的还有10、11、12、15号峰。另外有2、5、7、16号4个分子离子峰未能与hCNB理论氨基酸序列匹配,相对分子质量分别为1217.72、1521.97、1653.00、2488.23,可能是由于胰蛋白酶中残留的胰凝乳蛋白酶等产生的专属位点裂解,导致非Arg、Lys残基上切断而造成的。从质谱肽图分析,rhCNB的一级结构与hCNB理论氨基酸序列相符。

图9-56 rhCNB胰蛋白酶酶切MALDI-TOF-MS肽图谱

(资料来源:高锦,2004)

表9-9 rhCNB胰蛋白酶酶切MALDI-TOF-MS肽图谱

计算机辅助分析结果

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