王大虎

王大虎:蛋白质序列分析

这是肽图分析的重要应用之一。肽图上各峰经氨基酸分析并结合Edman降解或电喷雾质谱等手段,可得到每一肽段的精确序列。随着质谱技术的发展,反相肽图结合串联质谱已成为一种方便、快捷的序列测定方法,用于重组蛋白的测序。如果酶解过程中控制条件使二硫键不被破坏,通过比较二硫键还原前后的肽图即可判断二硫键的位置。与蛋白质数据库相结合进行分析,反相肽图还可对未知蛋白质进行鉴定。现有的研究成果包括:利用RP-HPLC对单克隆抗体A33进行了序列测定;利用反相肽图结合串联质谱对一种花粉蛋白中某肽段二硫键的位置进行了表征;利用RP-HPLC与质谱联用技术对LIM1215细胞中分离出的部分胞质蛋白进行了鉴定。

王大虎  2.分析蛋白质的细微结构差异

天然蛋白质的色谱通常无法反映蛋白质组成上的细微不同,而RP-HPLC以其高分辨率在揭示蛋白质结构细微差异上有出色的表现,即使一个氨基酸的改变也可通过相应肽段保留时间的变化清楚地反映出来。例如,肽段上脱酰胺作用常常引起保留时间的轻微延长,而氧化产物如甲硫氨酸亚砜或半胱磺酸的形成常引起保留时间的显著下降。同样,变异蛋白质的形成也会引起一个或多个肽段保留时间的变化。

在血红蛋白的研究中,人们已用RP-HPLC分析出多种变异体,还有人利用RP-HPLC肽图与质谱结合成功鉴定了又一种血红蛋白变异体β-134Val→Ala。由于RP-HPLC在识别蛋白质结构差异上的出色表现,已成为重组蛋白表征及药用蛋白质质量控制的一个有力工具,还可为许多疾病诊断提供依据。

3.蛋白质修饰分析

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随着人们对蛋白质修饰的研究不断深入,RP-HPLC不仅被用来分离修饰与未修饰产物,在修饰产物分析上也得到了很好应用。蛋白质修饰包括蛋白质在体内的翻译后修饰,例如形成N-甲酸基或N-乙酰基衍生物进行N末端封闭;形成氨基化物进行C末端封闭;丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸等含羟基的氨基酸磷酸化;天冬酰胺的N-糖基化及丝氨酸、苏氨酸的O-糖基化。还包括人工化学修饰,如PEG、葡聚糖修饰等。借助RP-HPLC可阐明蛋白质修饰的位点及其化学本质。

由于糖肽在RP-HPLC中的保留行为与其糖基化水平密切相关,糖基化程度越高,保留时间越短,因此可将糖蛋白水解成肽段X行反相色谱分析,从而得到糖基化水平及所处肽段。同样,磷酸化蛋白质中连接磷酸基的数量、位置等也可从RP-HPLC分析中得出。无论是翻译后修饰还是化学修饰,修饰位点的测定多采用对蛋白质作肽图后经比较确定被修饰的肽段,再结合质谱分析得到精确位点,这方面已做了许多有意义的工作。而且,利用和离子阱质谱结合对两种蛋白的磷酸化位点进行了分析,也得到了很好的结果。这一方法也可用于化学交联蛋白质分析,如交联核糖核酸酶(RNase)中的交联位点。该分析方法还可用于蛋白质活性位点及结合位点等的鉴定。但在有些蛋白质的大分子修饰位点判断中,修饰后的分子因酶解及肽段分离的影响会对分析造成困难。

王大虎 (三)酶活测定

随着RP-HPLC在临床及生物医药中的广泛应用,人们开始利用它来检测体内特定酶的活力。酶活力测定多采取分光光度法,但这种方法需要所测样品达到一定纯度。RP-HPLC可经特异监控底物及产物浓度直接测量X和组织中的酶活力,具有特异性强、简便快速的优点。通常将样品加入合适底物,通过加热、加酸或加入特定抑制剂终止反应,用RP-HPLC测定底物或产物浓度的改变,并计算出酶活力,也可直接从活体的X中底物或产物浓度变化来监测酶活力。例如,通过RP-HPLC监测腺苷的浓度来确定红血球中腺苷脱氨酶的活力,还借助RP-HPLC成功地测定了3′-AMP合成酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶、黄嘌呤氧化酶等的活力。另外,由于RP-HPLC可精确测定肽段的磷酸化,也有人将其用于酪氨酸激酶的活力测定。RP-HPLC表现出在这一领域的巨大潜力。

王大虎 (四)检测蛋白质构象的改变

RP-HPLC应用中的另一个重要方面是对多肽和蛋白质的不同构象中间体及其之间相互转变的研究,这方面已有大量工作,如对胰岛素、溶菌酶、重组生长因子和N-甲基重组生长因子及细胞色素等多种蛋白质及多肽在RP-HPLC的疏水环境中构象变化的研究。这些研究的共同特征是蛋白质和多肽的吸附和解吸附与溶剂或配基引起的构象改变有关。蛋白质在RP-HPLC固定相上的保留行为是基于蛋白质与固定相配基间的非特异性疏水相互作用,这种疏水作用力的强弱与蛋白质的结构尤其与蛋白质疏水基团的暴露程度有着密切的关系。它不仅取决于蛋白质的氨基酸序列,更取决于蛋白质与固定相发生作用时特定的空间构象。不同条件下,由于蛋白质构象变化会导致蛋白质疏水基团发生不同程度的暴露,与固定相配基作用的位点也随之变化,从而在RP-HPLC中反映出色谱行为的改变。因此,可以利用RP-HPLC来分析蛋白质分子表面疏水性和空间构象的稳定性。如果蛋白质或多肽的空间构象比较稳定,那么在各种不同的色谱条件下,蛋白质与配基的结合位点不容易改变,保留机制不变。反之,因空间构象的变化,就有可能采用不同的保留机制。这为构象中间体转变过程的动力学及热动力学的测定提供了直接手段。

RP-HPLC在蛋白质构象改变研究中的应用已表现出巨大潜力。例如,利用RP-HPLC技术证明了RNase A经三氯乙酸处理后构象的改变。还有人通过用RP-HPLC分离变化过程中的各种折叠中间体,动态监测了牛胰岛素在DTT作用下去折叠的过程。随着反相材料和检测手段的发展,RP-HPLC在蛋白质构象行为研究中的潜力已被越来越多的人所认识。

王大虎 (五)研究蛋白质折叠和稳定性中的疏水相互作用

RP-HPLC可用来研究蛋白质折叠和稳定性中的疏水作用。当前蛋白质化学家面临的最困难的问题之一就是理解蛋白质的折叠和稳定性,即蛋白质的氨基酸序列如何决定它的三维构象、折叠途径及稳定性。其中一个方法就是利用RP-HPLC作为生物系统的物理化学模型。由于驱动蛋白质折叠和稳定性的主要作用力是疏水相互作用,蛋白质与固定相配基间的疏水相互作用可很好地反映天然蛋白质分子中稳定其三级结构的非极性基团间的相互作用。Hodges等也采用一种双链β-螺旋的蛋白质模型系统在RP-HPLC中进行了蛋白质折叠和稳定性中的疏水相互作用的研究。目前这方面的工作不多,但相信随着研究的不断深入,RP-HPLC会逐渐成为蛋白质中疏水作用分析的一个有力手段。

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