王大虎

王大虎:结晶的方法

确定和优化形成优质晶体所需要的条件是一项比较困难的工作。假设在由pH、离子强度、反离子、温度等条件确定的X参数空间存在某个最优条件,而且没有理由认为这些因素可以独立优化,那么就需要大量的实验考察所有的组合。利用统计学方法已经能改变研究结晶条件的方式,该方法包括设计数量相对较少的实验、不完整的因素分析、选择覆盖整个参数空间范围的实验条件的随机组合等。常用的结晶方法有以下几种:

王大虎  (一)盐析法

盐析是通过加盐降低蛋白质溶解度,使其从溶解状态转变成过饱和状态,于是以结晶形式从溶液中析出。结晶用盐有各种无机盐(如X铵),有机盐(如柠檬酸钠、十六烷基三甲基铵盐)和各种分子质量的PEG等。盐类既可以固体形式加入,也可以饱和盐溶液形式加入。加盐时应注意边加边搅拌,防止局部盐浓度过高,搅拌不能激烈,以免产生气泡。当发现盐溶解速度明显变慢,则应在沉淀完全溶解后,静置片刻,观察溶液是否出现浑浊。加入的盐量应以维持浑浊不消失为度。加饱和盐溶液的优点是溶液与溶液易于混合,避免局部盐浓度过高,同时可免除气泡产生。

也可用透析的方法来增加样品的盐浓度。样品溶于水后,装入透析袋中,再将透析袋放入制好的结晶用盐溶液中。内外液的体积比一般为1∶10。结晶过程中,有时要更换外液几次。样品也可以直接溶于结晶用盐溶液中。这是利用蛋白质在低温时溶解度高,逐步升高温度溶解度降低的性质,使其从溶解状态很快转变成过饱和状态,并以结晶形式析出。

对于微量样品可用X界面扩散法、微量扩散法、微量透析法来提高盐浓度。

(二)有机溶剂法

有机溶剂的脱水作用会使大多数蛋白质的溶解度降低。其优点是有机溶剂介电常数小,所以,有机溶剂参入蛋白质溶液后,使溶液介电常数下降,导致蛋白质结晶析出。使用时有两点要注意:一是有机溶剂浓度不要过高;二是加入时局部浓度不要过高、或不要因混合热引起的局部溶液温度上升,这会引起蛋白质变性。所以加入的有机溶剂要事先冷却至0℃左右为好。常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、二氧杂环己烷、二甲基亚砜等。

加入有机溶剂的方式有下列几种:①直接加入有机溶剂。这时要注意搅拌、缓慢滴加、同时要测量温度。②气体平衡扩散。这是利用有机溶剂的挥发性,通过气体扩散而将溶剂加到蛋白质溶液中的方法。此法的优点是,第一,可缩短结晶时间;第二,样品溶液与有机溶剂分别置于密闭容器中(如干燥器),可避免直接加入法易产生无定形沉淀的弊病。③固体融化。将有机溶剂与水以1∶1混合后冷却,然后投入冷冻干燥的蛋白质干粉中,成一悬液。一般来说,蛋白质干粉由XX而成黏稠状,再由黏稠状转成结晶。④混合溶剂抽提。用30%丙酮处理刀豆粉,然后用滤纸过滤,滤液在2~2.5℃冷室放置过夜,即可出现脲酶结晶。

王大虎 (三)分批法

传统的结晶方法就是“分批法”,通过加入沉淀剂或者改变pH,直到蛋白质达到其溶解极限,形成少量的晶核,溶液静置一段时间后会生长出较大的晶体。分批实验的主要限制因素是沉淀要求保持静置,实验过程中惟一的变化是蛋白质浓度的降低。将系统脱离晶核形成区,防止晶核过度形成,有助于结晶化,但每次实验仅考察一套沉淀条件,所以设计实验之前需要先了解结晶条件。克服该限制因素的传统方法是缓慢降低蛋白质的溶解度,通过加热样品,置于绝热的真空瓶中,于冷室中缓慢冷却来完成。

传统分批法所采用的大量样品(100µL以上)适合于大晶体生长,但不适用于结晶条件的筛选。微量分批法最新的操作为,将一小滴蛋白质溶液浸入到石蜡油中,这样可避免溶液的蒸发,极微量的样品(小于1µL)也可以应用,因而该方法对于最初的筛选比较理想。该技术的进一步改进是采用石蜡油与聚硅氧烷油混合。聚硅氧烷油允许水分缓慢地扩散,随着水分的蒸发,液滴中蛋白质和沉淀剂的浓度会缓慢上升,这样,蛋白质和沉淀剂的浓度范围可在更小液滴中自动实现。该方法的缺点是液滴会在几星期内干透,除非保存在4~10℃,所以必须定时检查结晶。

(四)蒸汽扩散法

该方法将蛋白质液滴与沉淀剂混合,在密封的槽中通过与槽内高浓度沉淀剂相平衡而缓慢脱水。蛋白质液滴也可挂在密封槽的盖片上(即挂滴),或置于槽内的载体上(即点滴)。通常将等体积的蛋白质溶液和槽中溶液混合。蒸汽扩散法有利于自动筛选沉淀剂浓度范围,但与微量分批脱水实验不同,它有一个明确的终点。

选用的沉淀剂在液滴平衡动力学中也具有重要作用。含有盐类沉淀剂,如X铵的样品槽可在一两天内达到平衡,而含有PEG类沉淀剂的样品槽则需要1个多月。因此在只含有PEG的结晶过程中,经过几天生长得到的晶体可以认为类似于微量批次实验。加入适量的NaCl(如200mmol/L)可以将PEG结晶过程的平衡时间缩短至大约10d,但一般情况下,较长的平衡时间得到的晶体质量较好。

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王大虎 (五)其他方法

蛋白质溶解度明显受溶液pH影响,当蛋白质净电荷等于零时,即在等电点时,其溶解度往往最小,所以,可利用这一性质作等电点结晶。球蛋白易溶于盐溶液中而几乎不溶于水,这一性质可用于蛋白质结晶,用透析法则可达到除盐目的。有些蛋白质在低离子强度下,对温度特别敏感,其溶解度随温度变化极大,因此,可用温差法使其结晶,例如猪胰X蛋白酶(9mg/mL,内含pH5.5,0.05mol/L的柠檬酸钠缓冲液)溶液的温度逐渐由25℃降至20℃,晶体在24h内形成。金属离子常能促进蛋白质结晶生成,在用其他方法未获成功时,不妨尝试此法,例如,硫氧还蛋白在pH3.5~9.0,各种结晶试验均未获成功,但加入醋酸铜后,则出现结晶。

在蛋白质结晶过程中,蛋白质样品纯度不足可能会引起结晶的彻底失败,或只能得到小晶体,或不能得到良好衍射的大晶体。目的蛋白的微观不均一性可能比一些完全不相关的分子所造成的污染更为麻烦。X射线拓扑测定表明,晶体中的这些杂质引起晶体晶格产生一定的张力,降低了衍射的质量。

微观不均一性对蛋白质的结晶产生影响,微观不均一性可能来自于天冬酰胺或谷氨酰胺的脱酰胺作用,半胱氨酸的氧化,蛋白质水解,序列多晶型现象,转译后修饰的不确定性,如丝氨酸的磷酸化作用或者N末端甲基化或乙酰化等。

IEF分析与高于和低于等电点条件下PAGE联用,能够检测大多数潜在的微观不均一性问题。链内断裂可以通过还原条件下的SDS-PAGE检测到。日益广泛应用的蛋白质定性技术是电喷质谱技术,可以确定蛋白质共价结构中可能存在的有害于结晶的问题。

 

 

四、晶体的保存

 

晶体生成后,通常在其生长的母液中可长期保存一段时间,也可转移到相同组分的无蛋白质溶液中。在缺少沉淀剂的高浓度蛋白质溶液中生长的结晶经常会在这样的条件下重新溶解,而转移到含有沉淀剂的与初始生长环境相同的溶液中可使其稳定,将晶体短时间(15min)置于0.5%的戊二醛溶液中,可在晶体表面形成交联外壳,极大地提高了晶体对于不同条件的耐受性。观察表明,在X铵或PEG沉淀剂中生长的晶体长期在盐溶液中更为稳定。沉淀剂经常以高摩尔浓度存在,因而一般实验级试剂中的痕量杂质就会变得明显,所以与蛋白质接触的试剂采用最高质量级别为好。用于晶体生长或保存的缓冲溶液类型并没有严格的限制,但应注意,类似磷酸盐的物质以及随后结构分析中的重金属可能会产生严重的不溶性问题,而且在如甲基戊二醇、乙醇或高浓度的低分子质量PEG存在时,特别是在4℃下,甚至在相当稀的溶液中磷酸盐结晶也容易形成,因而采用PBS时有时会误认为晶体生长。

 

 

第九章│蛋白质的分析与检测

 

第一节 氨基酸序列分析

 

一、基本原理

 

蛋白质和多肽是由20种氨基酸按照一定的顺序通过肽键连接成一长链,然后通过链内、链间的离子键、疏水作用等多种作用力进行折叠卷曲形成一定的构象并发挥其独特作用。氨基酸的排列顺序即蛋白质的一级结构决定了蛋白质的高级结构及功能。因此,分析蛋白质的氨基酸序列是进行蛋白质结构功能研究中不可缺少的部分。

进行氨基酸序列分析,至少采用两种方法分别裂解多肽(裂解位置不同),分别纯化并测定产物氨基酸序列,比较两套肽段序列,找出断裂点相重叠部分(接头部分),即可得到完整的氨基酸序列。对于一次不能连续测出序列的大肽段,需进一步裂解。若多肽链含有二硫键或其他配基,如酰氨基时,还需要分别确定它们在序列中的连接位置。

 

 

二、氨基酸序列分析程序

 

(一)测序准备工作

在氨基酸序列分析前,必须做好样品的准备工作。内容包括:

(1)样品的纯度鉴定 采用多种互补有效的手段鉴定蛋白纯度,如SDS-PAGE、RP-HPLC、CE、IEC、亲和层析、肽(酶)谱分析等。

(2)脱盐 方法有RP-HPLC、凝胶过滤、透析、超滤、丙酮沉淀法等。

(3)巯基修饰 方法有丙烯酰胺修饰(包括还原、烷基化、脱盐),4-乙烯吡啶修饰(包括还原、烷基化、脱盐)等。

(4)蛋白质的分子质量测定 早期采用超离心分析和光散射法,目前常用方法有:SDS-PAGE法、凝胶过滤法、CE和质谱等。

(5)构成蛋白质的多肽链的数目和大小 多肽链的数目通常可以从测定每分子蛋白质所含的N末端残基数,结合SDS凝胶电泳推导出来。若肽链之间非共价交联,可用高浓度变性剂(如8mol/L尿素)或解聚剂(如SDS)拆离,将各种链分离纯化,然后分别测定各链的一级结构。若肽链是由二硫键共价交联,就得选用适当的化学反应断裂二硫键,并将断裂后出现的巯基保护起来,然后将各种链分离纯化,再进行各个肽链的一级结构测定。拆开二硫键的方法有过甲酸氧化法、还原-羧甲基化法等。

(6)蛋白质的氨基酸组成 根据分子质量和氨基酸组成,可计算其中各种氨基酸残基数目,以指导裂解蛋白质方法的选择。

(7)蛋白质的端基分析 端基分析有助于判断蛋白纯度,后续分析中识别N末端和C末端,有助于肽段拼接,也可以判断N末端是否封闭或酰胺化等。

(二)蛋白质的水解

(1)盐酸水解法 此法应用普遍,能较满意地得到Trp和Cys以外的其他所有氨基酸,而且较为简便。具体方法如下。

使用5.7mol/LHCl,真空状况下于110℃水解24~72h,在150℃下快速水解90min。Woodword等人用微波辐射法(150℃,20~25min)来水解蛋白质。通常情况下,水解后大部分氨基酸可定量回收,但Trp基本全被破坏,需借助其他方法。Ser、Thr分解缓慢,要准确测定,需要做几个水解时间实验,然后测定氨基酸含量,再推算分解时间为零时的氨基酸含量。含Val、Ile的肽链,因支链空间障碍而水解缓慢,故定量测定比较耗时。Cys可被部分破坏和氧化,宜在氧化成稳定的磺基丙氨酸后测定。Gln和Asn在酸水解中脱酰胺后变成Glu和Asp,测定水解释放出的氨量以计算Asn和Gln的总量,或者用不水解酰胺的方法水解肽键后直接测定。HCl水解时,Met易被氧化转变为甲硫氨酸砜,损失约20%,可以用这一数值进行校正,也可用保护剂(在盐酸中加入0.1%~1.0%巯基乙醇)来减少水解中Met的损失。HCl水解中Tyr的破坏率约为10%,若水解时加入0.1%~1.0%巯基乙酸和0.05%~0.1%苯酚,能明显提高Tyr、Ser回收率,同时Met也能免遭破坏。

(2)磺酸水解法 磺酸是非氧化性强酸,用4mol/L甲基磺酸,含0.2%β-吲哚基乙胺(色胺)进行水解,可使Trp的回收率达到90%以上,Ser和Thr的回收率接近定量值。其中Cys可用DTT还原水解液中的胱氨酸及其衍生物,然后用过量的连四X钠氧化,得到S-磺基半胱氨酸而加以测定。

(三)氨基酸的分离和定量测定

以IEC法分离氨基酸可分为柱后反应法和柱前衍生法两大类。前者是将游离氨基酸经过色谱柱分离后,再与显色剂(如茚三酮、荧光胺、邻苯二甲醛)反应。此法对样品预处理要求低,比较稳定,容易操作,缺点是灵敏度不高,操作时间长;后者是氨基酸先与化学偶联试剂作用,形成氨基酸衍生物,再经过色谱柱分离,直接检测衍生物。此法可检测OPA-、PTC-、PTH-、DABS-、Dansyl-和DABTH-氨基酸,灵敏度高,可利用HPLC分析,缺点是衍生物的不稳定性会干扰检测。

(1)茚三酮法 IEC后,氨基酸与茚三酮反应形成紫色产物,见图9-1,可于570nm比色测定,摩尔消光系数2×104。而蛋白质与茚三酮形成的黄色产物,于440nm比色测定,摩尔消光系数3×103。测定样品前,先用已知浓度的标准氨基酸的混合物做一次色谱分析,根据标准氨基酸的峰位、面积等参数来推算样品中的氨基酸。17种标准氨基酸混合液在氨基酸自动分析仪上的分析图谱如图9-2所示。

 

图9-1 茚三酮法原理图

 

图9-2 17种标准氨基酸混合液在氨基酸自动分析仪上的分析图谱

出峰顺序(从左到右):Asp、Thr、Ser、Glu、Pro、Gly、Ala、Cys、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、Lys、NH3、His、Arg

(资料来源:陶慰孙,1995)

(2)荧光胺法 室温下迅速和一级胺反应,产物的激发波长390nm,荧光波长475nm,反应如图9-3所示。

 

图9-3 荧光胺法定量测定氨基酸原理图

(3)OPA法 在巯基乙醇存在下,OPA能与一级胺作用生成具有强荧光的异吲哚衍生物,激发波长340~360nm,荧光波长455nm。

(4)苯氨基硫甲酰衍生物分析法 碱性条件下,异硫氰酸苯酯(PITC)与氨基酸反应形成苯氨基硫甲酰衍生物,在254nm检出。

(四)特殊氨基酸的测定

1.Trp的测定

由于Trp在酸水解后几乎全部破坏,需通过其他方法如碱水解(5mol/LNaOH)来测定。另外介绍以下两种方法:

(1)紫外吸收法 Trp和Tyr在280nm和290nm的紫外区有光吸收,可用完整的蛋白质进行Trp测定。先将蛋白质样品溶于6mol/L盐酸胍溶液中,然后分别在280nm和288nm测量蛋白质溶液的光吸收。Trp在288nm和280nm的摩尔消光系数分别是4815和5690;Tyr在288nm和280nm的摩尔消光系数分别是385和1280。根据比尔定律,可得如下式子:

 

在测得Tyr残基数的基础上,根据上式求Trp的残基数。

(2)对-二甲基氨基苯甲醛法 Trp在强酸条件下与醛反应生成带色产物。颜色的深浅与Trp的量成线性关系。该带色物质的最大吸收峰位于590nm,该法运用广泛,结果可靠。

2.巯基测定

主要方法有形成硫醇盐法、烷基化法和比色法,根据试剂与巯基反应后生成带色产物来进行测定的。

(1)5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)测定法 DTNB也称Ellman试剂,易溶于水,在巯基化合物的存在下,无色的DTNB将被转变成黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸,在412nm处具有最大吸收,DTNB的吸收光谱并不干扰巯基的测定。

(2)萘醌测定法 萘醌与巯基有当量加成关系,加成物在420nm左右有吸收峰,标准物和未知物在相同条件下测定,光密度增值与巯基浓度的关系在一定浓度范围内符合比尔定律。

3.二硫键的测定

(1)Ellman试剂法 当有一游离巯基存在时,Ellman试剂可与二硫键发生反应。虽然释放出的ES-(CNT)数与巯基数相等,但二硫键已被ES-裂解,形成DTNB(用ESSE表示)的衍生物(Ⓟ-S-S-E),反应式如图9-4所示。

 

图9-4 Ellman试剂法测定二硫键的原理图

在pH10.5碱处理与DTNB反应的蛋白质,则又从Ⓟ-S-S-E中释放出所有的CNT,这时发生碱催化的β-消除反应(如图9-5)。

 

图9-5 碱催化的β-消除反应

实际测定是先制成2mol/L硫氰酸胍、3mmol/L EDTA的蛋白质溶液并按前边提到的巯基测定法测定释放出的CNT量。然后再将这个溶液的pH调到10.5,再测定CNT量。二硫键的数目可按下式计算:

 

若蛋白质没有活泼巯基,可加入含巯基化合物,如Cys、谷胱甘肽和DTT,以启动此反应。

(2)2-硝基-5-硫代苯磺酸法 过量亚X钠与蛋白质反应可裂解蛋白质中的二硫键,如下式所示。

 

由于DTNB也与亚X盐作用,因此不能用来测定由亚X盐产生的蛋白质巯基的浓度,然而,2-硝基-5-硫代苯磺酸可用于测定这种情况下的巯基,因为它不与过量的亚X盐反应,但能与亚X盐释放的巯基作用,反应如下式所示:

 

实际测定时,含二硫键的蛋白质与2-硝基-5-硫代苯磺酸在暗处反应后,于412nm测定光吸收,用CNT的消光系数1.14×104L/(mol·cm)计算巯基数,此巯基数就是蛋白质中二硫键的数目。

 

 

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