大虎说事

王大虎:末端氨基酸的测定

末端分析可分为N末端测定和C末端测定两方面。

王大虎 (一)N末端的测定

组成蛋白质每条多肽链的第一个氨基酸与内部氨基酸不同,它具有α-氨基,并称为N末端。化X是先形成对酸较稳定的氨基衍生物,然后水解多肽,释放出标记的N末端氨基酸衍生物。酶学方法是用外切酶按顺序从N末端释放氨基酸。

(1)二硝基氟苯法 2,4-二硝基氟苯(DNFB,或称Sanger试剂)在温和条件下(pH8.0~9.0,室温)与肽链的N末端氨基作用,形成DNP-肽或DNP-蛋白,经HCl水解,除N末端氨基酸为黄色的DNP-氨基酸衍生物外,其余均为游离氨基酸。虽然多肽侧链上ε-NH2、酚—OH等也能与DNFB反应,但在用有机溶剂抽提时将与游离氨基酸一起留在水相,而与α-DNP氨基酸区分开来,可用纸层析、薄层层析、HPLC等进行鉴定和定量。

DNP-氨基酸见光易分解,所以整个操作应在暗处进行。DNFB与蛋白质的反应如图9-6所示。

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图9-6 DNFB与蛋白质的反应图

(2)丹磺酰氯法 丹磺酰氯(DNS)是一种荧光试剂,能专一地与N末端的α-氨基反应,生成氨磺酰衍生物DNS-肽,经盐酸水解,得DNS-氨基酸和其他游离氨基酸。反应式如图9-7所示。

 

图9-7 DNS与多肽N末端的反应图

反应产物DNS-氨基酸在紫外线下有强烈荧光,检测灵敏度可达10-10~10-9mol,比DNFB法高100倍。而且水解后的水解物不需提取,相应的DNS-氨基酸可直接用电泳或色谱法鉴定。

(3)苯异硫氰酸酯法 与氨基酸的α-氨基一样,多肽或蛋白质的N末端氨基也能与苯异硫氰酸酯(PITC,Edman试剂)作用,生产PTC-多肽或蛋白质,在酸性有机溶剂中加热时,N末端的PTC-氨基酸发生环化,生产苯乙内酰硫脲的衍生物(PTH-氨基酸),并从肽链上脱落下来,而剩下的肽链仍然完整。PTH-氨基酸经有机溶剂抽提干燥,可用薄层色谱、气相色谱、HPLC等鉴定。此法还可用来测定氨基酸序列,即Edman降解法,见后面“肽段的序列测定”。

(4)氨肽酶法 对于用DNS法不能确定的N末端或者要测定对酸水解不稳定的残基,可用氨肽酶裂解法。氨肽酶可从N末端开始顺序切下残基。但由于切下的速度不同,可能导致结果难以解释。亮氨酸氨肽酶优先释放疏水氨基酸,但释放酸性残基的速度则非常慢。氨肽酶具有较广的专一性。此法的灵敏度不如DNS法。

(5)封闭N末端的测定 N末端封闭的蛋白质或肽不能与上述试剂反应。N末端残基封闭的情况很多,例如乙酰化(兔肌红蛋白)、甲酰化(蜂毒素)、焦谷氨酸环化(兔免疫球蛋白)、丙酰氯环化及个别多肽形成的环状分子(短杆菌酪肽A)等。

降解N末端焦谷氨酰残基的方法有酶解法和化学降解法两种。酶解法用焦谷氨酸氨肽酶,专一裂解焦谷氨酰N末端的,用色谱法鉴定,剩余肽链可正常测序,见图9-8所示。

 

图9-8 酶解法降解N末端焦谷氨酰残基

化学降解法是用HCl-甲醇试剂。在温和条件下,该试剂能打开焦谷氨酰残基的吡咯烷酮环,暴露其α-氨基,反应如图9-9所示。

 

王大虎 图9-9 化学降解法降解N末端焦谷氨酰残基

用HCl-甲醇反应后,使谷氨酸残基上带一个γ-甲基酯,暴露的α-氨基则能被Edman试剂偶合,然后按正常方法降解。

N末端甲酰基可通过温和酸水解法除去,而不致引起肽键严重裂解,或者用来自大肠杆菌的脱甲酰基酶除掉。

(二)C末端的测定

蛋白质C末端测序方法主要有化X、羧肽酶法和串联质谱法。

1.化X

化X包括(异)硫氰酸法、过氟酸酐法、肼解法和还原法等。

(1)(异)硫氰酸法 (异)硫氰酸法,又称Schlack-Kumpf降解,原理类似N末端Edman降解。(异)硫氰酸与蛋白质或多肽的α-羧基反应,形成蛋白质或多肽乙内酰硫脲,再用裂解试剂切下C末端残基,形成氨基酸乙内酰酸脲,然后利用HPLC系统分离分析游离的氨基酸乙内酰酸脲,根据在HPLC上保留时间来确定氨基酸残基。步骤如下:

①活化:C末端X羧基与乙酸酐反应生成混合酸酐,并进一步环化成咪唑团,而侧链上的羧基形成的混合酸酐则难以成环。C末端的咪唑团在四丁基硫氰酸氨的作用下,转化为乙内酰硫脲(TH)。

②酰胺化保护侧链羧基:侧链羧基形成混合酸酐后,与硫氰酸哌啶进一步作用形成酰胺,以保护侧链。

③烷基化:由于C末端环化成的TH衍生物较为稳定而不易被切割,因此产率不高。用溴代甲基萘选择性地烷基化修饰硫原子,形成烷基化-乙内酰硫脲(ATH)衍生物,裂解产率将大大提高。

④修饰Thr和Ser的羟基:蛋白质和多肽中的羟基会干扰测序,因此需要修饰。在活化过程中,乙酸酐也会与羟基反应将其乙酰化,但反应不完全,在N-甲基咪唑(NMI)和乙酸F的共同作用下,Thr和Ser上的羟基基本被乙酰化。

⑤裂解和衍生:C末端的ATH衍生物在酸性条件下与[NCS]-反应,而被裂解生成ATH-氨基酸,新的C末端自动形成TH,而不必重新活化。

因此,整个测序过程只需在开始时对C末端进行一次性活化,并修饰Asp和Glu侧链羧基,以及Thr和Ser的羟基。实际上循环反应的只有烷基化和裂解两步,如图9-10所示。

 

图9-10 异硫氰酸法C末端序列分析过程示意图

(2)过氟酸酐法 原理是C末端氨基酸残基的α-羧基与混合酸酐反应后,通过酮-烯醇转换成氧氮杂环戊酮(唑酮),然后利用过氟酸或TFA,把这个环从C末端截掉。然后反应依次连续进行。用质谱测定反应产物的分子质量,通过相邻分子质量的差值就可以得到其C末端序列。

(3)肼解法 蛋白质或多肽与无水肼共热发生肼解,除C末端氨基酸以游离形式存在外,其他氨基酸都转变为相应的氨基酸酰肼化物。氨基酸酰肼可与苯甲醛作用变为水不溶的二苯基衍生物而沉淀,借助DNS法或DNFB法可鉴定C末端氨基酸。

(4)还原法 肽链C末端氨基酸被硼氢化锂还原成相应的α-氨基醇,水解肽链后以色谱法鉴定。

2.羧肽酶法

羧肽酶是一类外肽酶,专一地从肽链的C末端开始逐个降解,释放出游离氨基酸,表9-1所示为常用4种羧肽酶的性质及其酶解条件。释放氨基酸的检测有:①色谱法,直接检测释放的氨基酸;②质谱法,测定相对分子质量的差值推断所释放氨基酸。

表9-1 4种羧肽酶的性质及其酶解条件

 

3.串联质谱法

串联质谱(MS/MS)是指能够进行多级质谱分析的质谱仪。原理是将蛋白质经胰蛋白酶或其他酶酶切后,直接用串联质谱测定酶切肽段混合物,然后通过一级质谱选择C末端肽段离子进行串联质谱分析而得到C末端序列。串联质谱法测定蛋白质C末端序列的关键是对C末端肽段的判断。对于已知序列的蛋白质,可根据序列和酶切位点计算出C末端肽段的理论相对分子质量。对于未知序列的蛋白质,则C末端肽段的判断有18O标记法和Anhydrotrypsin法。

 

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